[發明專利]一種干細胞外泌體的提取方法

在審

• 申請號: 202010941645.0
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112080460A
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 李勝;劉麗婕;李璋;蘇昕;申敏;張作春
• 申請（專利權）人: 山東發現生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

1.一種干細胞外泌體的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、采用含血清培養基培養干細胞，培養至一定時間，然后提取干細胞，將干細胞放置在不含血清的培養基中，培養至一定時間；

S2、祛除S1中不含血清培養基中的干細胞進行過濾干細胞，提取剩下部分；

S3、將S2中獲取的提取液進行離心并進行下一步沉淀，等待一定時間，將沉淀后的液體進行收集；

S4、將S3收集的液體進行密度梯度離心，將提純的液體通過收集管進行高純度外泌體的收集。

2.根據權利要求1所述的一種干細胞外泌體的提取方法，其特征在于，在根據S1中的操作步驟中，向容器內加入所需水量的一部分，按照培養基的配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最后應在全部原料溶解后加水補足，將培養基倒置過來，平放在恒溫箱里，18～24小時后檢查，如培養基末長雜菌，即可用來培養微生物，然后進行實驗，在含血清培養基中進行無菌環境培養24～36小時，在不含血清的培養基中進行無菌環境培養36～48小時麻將培養后的干細胞放置在采血袋中。

3.根據權利要求1所述的一種干細胞外泌體的提取方法，其特征在于，在根據S2中的操作步驟中，根據細胞的大小不同，可通過超濾膜過濾膜具，使用0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔徑對不同大小的干細胞進行過濾，再將離心過的采血袋倒置的懸掛在分漿夾的固定擠壓板上,用5ml的注射器從采血袋的熱合掉的端口扎入，用于提取液體，將提取液放置無菌存放盒中。

4.根據權利要求1所述的一種干細胞外泌體的提取方法，其特征在于，在根據S3中的操作步驟中，使用EP管將提取液進行濃縮處理，并將提取液與含聚合物的沉淀溶液混合，并將混合后液體的液體放置在4℃溫育并低速離心，聚合物一般使用聚乙二醇。

5.根據權利要求4所述的一種干細胞外泌體的提取方法，其特征在于，在根據S3中的操作步驟中，將混合沉淀的液體放置商品化試劑盒中，沉淀20～30小時，通過提取管將放置商品化試劑盒中上清液體進行去除，并將沉淀物用注射器進行收集，放置無菌低溫環境下進行存儲。

6.根據權利要求1所述的一種干細胞外泌體的提取方法，其特征在于，在根據S4中的操作步驟中，通過注射器將沉淀物注射至離心容器中，在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續分布的密度階層，通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍收集，實現外泌體分離。

7.根據權利要求1所述的一種干細胞外泌體的提取方法，其特征在于，在根據S4中的操作步驟中，將外泌體通過收集管進行提取，并通過注射器將外泌體溶于100ul生理鹽水中，通過無菌容器進行收集，此外通過注射器提取1mg外泌體溶于10ul生理鹽水中，放入無菌低溫環境中，用于備用。