[發(fā)明專利]敲低Seroin1基因的家蠶雙元轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)及家蠶純裸蛹品種的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010941104.8
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112011540B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設計）人: 趙萍;張曉璐;董照明;郭凱雨;夏慶友
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 重慶航圖知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

1.家蠶中敲低Seroin1基因表達在制備家蠶純裸蛹品種中的應用，其特征在于：所述敲低Seroin1基因表達使用敲低Seroin1基因的家蠶雙元轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括基于piggyBac 的Cas9表達載體和靶標Seroin1基因的sgRNA表達載體。

2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于：所述sgRNA的位點序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于：所述sgRNA表達載體由以下方法制備：將SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列退火形成雙鏈連入gRNA表達載體，然后將U6-gRNA-TTTTT 替換pBac[U6-gRNA-gLMN, 3xp3-EGFP]載體上的P_U6-gLMN-gRNA scaffold-T6獲得sgRNA表達載體。

4.家蠶純裸蛹品種的制備方法，其特征在于：通過在家蠶中敲除Seroin1基因，篩選純合突變個體，獲得家蠶純裸蛹品種。

5.根據(jù)權利要求4所述家蠶純裸蛹品種的制備方法，其特征在于：所述敲除Seroin1基因表達的方法是通過ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9或其變體介導靶標seroin1基因敲除。

6.根據(jù)權利要求4所述家蠶純裸蛹品種的制備方法，其特征在于：所述敲除Seroin1基因表達的方法是通過CRISPR/Cas9介導敲除家蠶seroin1基因。

7.根據(jù)權利要求6所述家蠶純裸蛹品種的制備方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9介導敲除家蠶seroin1基因由Cas9表達載體與靶標Seroin1基因的sgRNA的雙元轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)介導。

8.根據(jù)權利要求7所述家蠶純裸蛹品種的制備方法，其特征在于：所述靶標Seroin1基因的sgRNA由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列退火形成雙鏈。

9.根據(jù)權利要求4所述家蠶純裸蛹品種的制備方法，其特征在于：制備Cas9轉(zhuǎn)基因家蠶；然后構建靶標seroin1基因的sgRNA表達載體，并制備sgRNA轉(zhuǎn)基因家蠶；將sgRNA轉(zhuǎn)基因家蠶和Cas9轉(zhuǎn)基因家蠶進行雜交、熒光篩選不可再繼續(xù)產(chǎn)生編輯的個體進行PCR分型檢測，篩選到雜合體，雜合體自交，經(jīng)過對突變序列的分型檢測及克隆測序鑒定出后代中的純合突變個體，獲得家蠶純裸蛹品種。

10.根據(jù)權利要求9所述家蠶純裸蛹品種的制備方法，其特征在于：所述sgRNA表達載體由以下方法制備：將SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列退火形成雙鏈連入gRNA表達載體，然后將U6-gRNA-TTTTT 替換pBac[U6-gRNA-gLMN, 3xp3-EGFP]載體上的P_U6-gLMN-gRNA scaffold-T6獲得sgRNA表達載體。