[發明專利]一種轉座酶的篩選報告載體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010940614.3
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112899296A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 文雯;宋姍姍;劉韜;劉祥箴;金華君;錢其軍
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療研究院;上海細胞治療集團有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N15/54;C12N15/66;C12N1/19;C12Q1/48;C12R1/865
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

1.一種轉座酶的篩選報告載體，其特征在于，篩選具有轉座酶活性的生物活性物質，含有

(1)URA3基因表達盒，URA3基因中含有轉座子片段，轉座子片段可操作地插入URA3基因中TTAA處，轉座子片段的5’IR與3’IR之間含有抗生素抗性基因；及

(2)轉座酶基因表達盒，轉座酶片段可操作地連接有誘導型啟動子元件。

2.根據權利要求1所述的篩選報告載體，其特征在于，URA3基因表達盒與轉座酶基因表達盒相對獨立地分布，或者轉座酶基因表達盒可操作地插入URA3基因表達盒中的轉座子片段中。

3.根據權利要求1所述的篩選報告載體，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括四環素抗性基因、大環內酯抗生素抗性基因或者氨基糖苷類抗生素抗性基因，優選氨基糖苷類抗生素抗性基因；所述氨基糖苷類抗生素基因包括G418抗性基因或卡那霉素抗性基因Npt，優選G418抗性基因；

所述轉座子片段包括SB轉座子片段、PB轉座子片段、P因子片段、Tn轉座子片段或者IS轉座子片段，優選PB轉座子片段或SB轉座子片段；

所述轉座酶片段包括SB轉座酶片段、PB轉座酶片段、P轉座酶片段、Tn轉座酶片段或者IS轉座酶片段，優選PB轉座酶片段或者SB轉座酶片段；

所述誘導性啟動子元件包括誘導型GALS啟動子、誘導型AOX1啟動子或者誘導型PAOX1啟動子，優選為誘導型GALS啟動子；

所述具有轉座酶活性的生物活性物質包括PB轉座酶、SB轉座酶、P轉座酶、Tn轉座酶或者IS轉座酶，優選PB轉座酶或SB轉座酶。

4.根據權利要求1所述的篩選報告載體，其特征在于，URA3基因中含有的轉座子片段同轉座酶基因表達盒中轉座酶片段表達的轉座酶間特異性選擇。

5.權利要求1至4任一項所述的篩選報告載體的制備方法，其特征在于，步驟包括：含有URA3基因表達盒的線性片段同與之有同源序列的含有抗生素抗性基因的轉座子片段，經同源重組酶連接，得含有URA3基因表達盒的載體，URA3基因中可操作地插入轉座子，轉座子中可操作地插入抗生素抗性基因；

可操作地連接有誘導型啟動子元件的轉座酶片段，在限制性內切酶作用下，克隆至含有URA3基因表達盒的載體上，得轉座酶的篩選報告載體，URA3基因表達盒與轉座酶基因表達盒連接于同一載體上。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，含有URA3基因表達盒的線性片段的制備包括：設計引物從URA3基因的TTAA處對含有URA3基因表達盒的模板載體進行PCR，得到含有URA3基因表達盒的線性片段；優選地，設計引物pURA-F：SEQ ID NO:1和pURA-R：SEQ IDNO:2對模板載體PRS316進行PCR，得到含有URA3基因表達盒的線性片段；優選地，所述模板載體為酵母菌質粒載體，更優選為PRS316。

同含有URA3基因表達盒的線性片段具有同源序列的含有抗生素抗性基因的轉座子片段的制備包括：設計引物對5’IR與3’IR之間含有抗生素抗性基因的轉座子進行PCR，使得到的含有抗生素抗性基因的轉座子片段同含有URA3基因表達盒的線性片段具有同源序列；優選地，設計引物pURA-IR-F：SEQ ID NO:3和pURA-IR-R：SEQ ID NO:4對5’IR與3’IR之間含有抗生素抗性基因的轉座子進行PCR，使得到的含有抗生素抗性基因的轉座子片段同含有URA3基因表達盒的線性片段具有同源序列。

7.權利要求1至4任一項所述的篩選報告載體構建的突變體庫。

8.一種轉座酶的突變體庫，其特征在于，包含分別轉染不同的突變的轉座酶開放閱讀框架片段的URA缺陷型的酵母菌株；每個URA缺陷型的酵母菌株內，突變的轉座酶開放閱讀框架片段酶切連接于權利要求1-6任一項所述的篩選報告載體的轉座酶基因表達盒內，替換轉座酶基因表達盒內未經突變的轉座酶開放閱讀框架片段。優選URA缺陷型的酵母菌株包括BJ2168、Y187、YBZ-1或YZH-Gold，更優選為URA缺陷型的釀酒酵母菌株BJ2168。