[發(fā)明專利]一種高活性轉(zhuǎn)座酶及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010940595.4
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112899252A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 文雯;宋姍姍;劉韜;劉祥箴;金華君;錢其軍
• 申請（專利權(quán)）人: 上海細(xì)胞治療研究院;上海細(xì)胞治療集團(tuán)有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/81;C12N15/85;C12N1/19;C12N5/10;C12R1/865
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種高活性轉(zhuǎn)座酶及其應(yīng)用，該高活性轉(zhuǎn)座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，該氨基酸序列的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，由該氨基酸序列為基礎(chǔ)的高活性轉(zhuǎn)座酶用于轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可顯著提高轉(zhuǎn)座子的基因轉(zhuǎn)移活性，該高活性轉(zhuǎn)座酶酶及編碼該高活性酶的核苷酸序列可用于構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，制備或用作基因組研究、基因治療、細(xì)胞治療、或者多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)和/或分化的藥物、制劑或工具等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種高活性轉(zhuǎn)座酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

DNA轉(zhuǎn)座子是一段可移動(dòng)的DNA序列，可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位置。PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子是從粉紋夜蛾(Trichoplusiani)TN368細(xì)胞系中分離的一種DNA轉(zhuǎn)座子，可特異性的插入到“TTAA”把位點(diǎn)，借助轉(zhuǎn)座酶，PiggyBac轉(zhuǎn)座子可將目的基因從宿主精確切離，且不會使宿主染色體發(fā)生重拍。PB轉(zhuǎn)座子沒有潛在的病毒遺傳毒性，可攜帶較長外源基因片段(最多150kb)，具有很強(qiáng)的改造型。由PB轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因具有整合效率高、穩(wěn)定整合、長期表達(dá)、單拷貝整合、插入位點(diǎn)可定位、操縱簡便等特點(diǎn)，常運(yùn)用在轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)、小鼠胚胎干細(xì)胞遺傳學(xué)操作、基因誘變等基因操作、多能干細(xì)胞誘導(dǎo)等多個(gè)領(lǐng)域。

PB轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座活性在現(xiàn)有哺乳動(dòng)物DNA轉(zhuǎn)座子中是最高的，具有很廣泛的運(yùn)用前景。國內(nèi)外已有許多研究將PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)作為一種基因編輯的方法，運(yùn)用在多種生物中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因和基因突變，包括昆蟲細(xì)胞、原生生物、植物和脊椎動(dòng)物。2003年，Tomita將人類III型膠原蛋白與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP融合，使用PB轉(zhuǎn)座子整合到家蠶蠶絲蛋白基因中，獲得了能穩(wěn)定表達(dá)人類膠原蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶。2005年，Balu將人二氫葉酸還原酶(hDHFR)通過PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將其插入虐原蟲基因組中。2014年，Eric T獲得了PB轉(zhuǎn)座子能進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)座的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系。2005年，Sheng Ding通過PB轉(zhuǎn)座子將外源基因片段高效導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞和小鼠細(xì)胞株，并使其穩(wěn)定表達(dá)，培育出性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因熒光小鼠，證明了PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可作為一種有效的操作工具用于研究其他脊椎動(dòng)物基因功能的可能性。

DNA轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由兩部分組成，兩端帶有反向重復(fù)序列(IRs)可攜帶目的DNA片段的轉(zhuǎn)座子和能催化轉(zhuǎn)座子發(fā)生“剪切和粘貼”的轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶首先結(jié)合轉(zhuǎn)座子兩側(cè)的IRs序列，然后將轉(zhuǎn)座子從宿主DNA位點(diǎn)精準(zhǔn)地?zé)o痕移除，最終將DNA片段整合到新的位點(diǎn)上。高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的建立可以實(shí)現(xiàn)對靶基因的定點(diǎn)敲除或者目的基因的定點(diǎn)引入，為哺乳細(xì)胞內(nèi)的基因編輯提供有效的載體工具。轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座效率決定了基因編輯的效率，而轉(zhuǎn)座效率很大一部分取決于轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)水平，因此，增加轉(zhuǎn)座酶活性是增加轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座效率的關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)。

轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座活性受結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)等因素的影響，目前尚未對轉(zhuǎn)座酶的晶體結(jié)構(gòu)作出清晰的解析，但有部分結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是重要結(jié)構(gòu)，且實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)座酶的活性可由任何一個(gè)非特殊氨基酸影響。

一種用于哺乳動(dòng)物的高活性PiggyBac轉(zhuǎn)移酶(A hyperactive piggyBactransposase for mammalian applications,PNAS|January 25,2011|vol.108|no.4|1531–1536)公開一種轉(zhuǎn)座效率為mPBase(經(jīng)哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化的野生型PiggyBac轉(zhuǎn)移酶)10倍的進(jìn)行以下位點(diǎn)氨基酸突變的高活性PiggyBac轉(zhuǎn)移酶(指下述現(xiàn)有高活性轉(zhuǎn)座酶hyPBase，如SEQ ID NO:1所示)：I30V、G165S、S103P、M282V、S509G、N570S和N538K。