[發明專利]藥用植物活性化合物生物合成基因SNP位點的鑒定方法

有效

• 申請號: 202010939258.3
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN111876521B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 王志才;王美娜;陳建兵;趙美麗;崔洪秋;張佳瑩
• 申請（專利權）人: 深圳市蘭科植物保護研究中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 崔立立

本發明提供一種藥用植物活性化合物生物合成基因單核苷酸多態性(SNP)位點的鑒定方法，包括：參考序列獲取步驟，包括獲取目標化合物的生物合成相關基因的參考序列；測序步驟，包括根據所述參考序列設計用于擴增目的基因的特異性引物，從取自生物體的樣本中擴增獲得可生物合成所述目標化合物的目的基因，測序得到基因序列；比對步驟，包括將所述參考序列與測序得到的所述基因序列進行比對，找出候選單核苷酸多態性位點。本發明建立了一種基于擴增子序列快速獲取及鑒定SNP位點的方法，能夠快速準確鑒定SNP位點，能夠針對任何代謝途徑中的多種基因進行針對性的SNP位點開發。

技術領域

本發明涉及單核苷酸多態性位點鑒定技術領域，具體涉及藥用植物活性化合物生物合成基因SNP位點的鑒定方法。

背景技術

單核苷酸多態性(Single?Nucleotide?Polymorphism，SNP)是一種新型的分子遺傳標記，是指基因組序列上單個堿基變異(主要包括轉換、顛換)引起的DNA序列多態性，在作物品種鑒定等方面有廣泛應用。與第一代分子標記(如限制性片段長度多態性RFLP)、第二代分子標記(如簡單重復序列區間標記ISSR)相比，SNP標記具有諸多優點，如操作相對簡單方便、位于基因組上的多態性位點豐富、利于自動化，穩定性和可靠性更高等。目前主要通過公共數據庫序列比對和測序兩種常用的方法進行SNP的位點鑒定。在部分藥用植物完成基因組測序前，SNP可以基于公共數據中的表達序列標簽EST序列比對出來。雖然基于公共數據庫較容易獲得大量的SNP，但根據不同篩選閾值和條件得到的SNP標記存在差異，在后期有效的SNP位點驗證時工作量較大。測序法的具體應用主要包括基于二代測序技術和三代測序技術的全基因組測序和高通量測序進行序列比對，開發大規模的SNP位點。除了測序成本較高外，所開發的SNP位點是遍在的，大都與化合物特定理化特性不對應，因而不具有針對性。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是如何提高SNP位點鑒定的準確性，減少SNP位點鑒定的工作量，降低SNP鑒定成本。

根據第一方面，一種實施例中提供一種藥用植物活性化合物生物合成基因單核苷酸多態性位點的鑒定方法，包括：

參考序列獲取步驟，包括獲取目標化合物的生物合成相關基因的參考序列；

測序步驟，包括根據所述參考序列設計用于擴增目的基因的特異性引物，從取自生物體的樣本中擴增獲得可生物合成所述目標化合物的目的基因，測序得到基因序列；

比對步驟，包括將所述參考序列與測序得到的所述基因序列進行比對，找出候選單核苷酸多態性位點。

根據第二方面，一種實施例中提供一種基因組合在石斛堿生物合成基因單核苷酸多態性位點鑒定中的應用，所述基因組合含有乙酰CoA?；D移酶(AACT)基因、2-C-甲基-D-赤蘚糖-4-磷酸胞苷轉移酶(MCT)基因、細胞色素氧化酶(CYP94C1)基因、甲羥戊酸激酶(MK)基因中的至少一種。

根據第三方面，一種實施例中提供一種引物組合在石斛堿生物合成基因單核苷酸多態性位點鑒定中的應用，所述引物組合含有SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.8所示序列或其互補序列中的至少一種。

在一實施例中，通過擴增子測序，實現對特定基因的SNP位點進行鑒定。

在一實施例中，通過設計特異性引物對特定基因的SNP位點進行鑒定，準確率更高，更有針對性。

附圖說明

圖1顯示為鐵皮石斛總RNA提取結果圖。

圖2顯示為石斛堿生物合成相關基因PCR擴增結果圖。

圖3顯示為菌落PCR鑒定陽性克隆結果圖。

圖4顯示為AACT的SNP位點及對應的氨基酸變化圖。

圖5顯示為CYP94C1的SNP位點及對應的氨基酸變化圖。