[發(fā)明專利]一種利用軟骨特異性基因表達(dá)程度控制軟骨質(zhì)量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010938065.6
• 申請日: 2020-09-09
• 公開（公告）號: CN112048563B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權(quán)）人: 福建華民生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;A61K35/32;A61P19/08
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明涉及一種利用軟骨特異性基因表達(dá)程度控制軟骨質(zhì)量的方法，利用CRTL1基因表達(dá)程度控制培養(yǎng)軟骨細(xì)胞質(zhì)量，確保體外擴(kuò)增培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞移植后在體內(nèi)可以形成健康的軟骨。利用本發(fā)明方法篩選得到的軟骨在體內(nèi)具有良好的軟骨組織形成能力、修復(fù)能力。本發(fā)明方法方便快捷，為提高軟骨培養(yǎng)質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用軟骨特異性基因表達(dá)程度控制軟骨質(zhì)量的方法。

背景技術(shù)

培養(yǎng)軟骨是世界上公認(rèn)的治療軟骨損傷的有效方法。培養(yǎng)軟骨是從患者的膝蓋非加重區(qū)域去少量的軟骨組織，用酶消化提取軟骨細(xì)胞，并對軟骨細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增后，把培養(yǎng)軟骨移植到膝蓋軟骨的缺口上。那么，在體外擴(kuò)增的培養(yǎng)軟骨細(xì)胞被移植后在體內(nèi)到底能否形成正常的軟骨，這是保證培養(yǎng)軟骨質(zhì)量保證的重要課題。

軟骨細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)，軟骨細(xì)胞的特異性基因的表達(dá)較高。但在體外的培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，軟骨特異性基因AGG，COL-2，SOX-9, CRTL1的表達(dá)會隨著培養(yǎng)軟骨擴(kuò)增次數(shù)的增加而降低，與此同時(shí)非特異性基因的表達(dá)會隨之增加。治療膝蓋軟骨損傷的培養(yǎng)軟骨通常是把軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增后注入膝蓋關(guān)節(jié)。現(xiàn)有的細(xì)胞質(zhì)量指標(biāo)主要是細(xì)胞數(shù)量，生存率（% ofliving cells），細(xì)胞的無菌性，含雜質(zhì)的量，內(nèi)毒素，支原體等。目前還沒有合適的指標(biāo)可直接細(xì)胞在體內(nèi)軟骨的形成能力。如何保證培養(yǎng)軟骨細(xì)胞質(zhì)量，以確保被移植細(xì)胞能夠在體內(nèi)形成新的彈性軟骨是培養(yǎng)軟骨是培養(yǎng)軟骨產(chǎn)品開發(fā)的痛點(diǎn)。

我們認(rèn)為雖然軟骨細(xì)胞的特異性基因的表達(dá)會隨著傳代的增加而逐步下降，但這些基因表達(dá)只有能保持在一定水平以上就可以確保被移植的培養(yǎng)軟骨細(xì)胞能夠在體內(nèi)形成新的彈性軟骨。然而如何篩選出與軟骨質(zhì)量密切相關(guān)的特異性基因，以及如何利用特異性基因的表達(dá)程度來管控軟骨細(xì)胞的質(zhì)量，是本領(lǐng)域的一大技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用軟骨特異性基因表達(dá)程度控制軟骨質(zhì)量的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

以GAPDH作為內(nèi)參通過測量培養(yǎng)軟骨細(xì)胞中軟骨特異性基因的表達(dá)程度，來控制培養(yǎng)軟骨細(xì)胞質(zhì)量，確保培養(yǎng)軟骨細(xì)胞移植后在體內(nèi)可以形成健康的軟骨。

所述軟骨特異性基因?yàn)镃RTL1基因。

培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的CRTL1基因表達(dá)程度大于0.060時(shí)，判定為質(zhì)量良好；所述CRTL1基因表達(dá)程度= CRTL1拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）本發(fā)明篩選得到的軟骨細(xì)胞特異性基因CRTL1與軟骨質(zhì)量能呈現(xiàn)良好的關(guān)聯(lián)關(guān)系，CRTL1基因表達(dá)程度（CRTL1拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)）大于0.032時(shí)，在3D培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞能夠生成正常軟骨的基質(zhì)，形成軟骨狀組織。

（2）本發(fā)明判定方法方便快捷，利用本發(fā)明方法篩選得到的軟骨在體內(nèi)具有良好的軟骨組織形成能力、修復(fù)能力。本發(fā)明方法方便快捷，為提高軟骨培養(yǎng)質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為CH6培養(yǎng)軟骨細(xì)胞經(jīng)過3D培養(yǎng)28日后形成的軟骨狀組織；A：培養(yǎng)28日后的3D培養(yǎng)軟骨，B:培養(yǎng)28日后的軟骨狀組織的番紅O法(Safranin O)染色結(jié)果。

圖2為培養(yǎng)軟骨細(xì)胞傳代次數(shù)對培養(yǎng)軟骨細(xì)胞在體內(nèi)形成軟骨能力的影響；A為第3代染色結(jié)果；B為第5代染色結(jié)果；C為第9代染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，滑膜細(xì)胞的CRTL1基因表達(dá)水平