[發(fā)明專利]一種監(jiān)測DNA順式元件在植物中表達模式的無損報告系統(tǒng)、構建方法及其應用

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• 申請日: 2020-09-08
• 公開（公告）號: CN112063650A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 和玉兵
• 申請（專利權）人: 南京農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/53;C12N15/54;A01H5/00;A01H6/20;A01H6/46
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

1.一種監(jiān)測DNA順式元件在植物中表達模式的裸眼可視無損報告系統(tǒng)，其特征在于，所述無損監(jiān)測報告系統(tǒng)為包括順次設置待監(jiān)測的DNA順式元件、甜菜紅素生物合成基因RUBY基因、終止子的載體。

2.根據(jù)權利要求1所述的無損篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述RUBY基因包括CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因；

所述CYP76AD1基因的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.1所示CYP76AD1氨基酸序列的核苷酸序列，

所述DODA基因的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.2所示DODA1氨基酸序列的核苷酸序列，

所述GT基因的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.3所示GT氨基酸序列的核苷酸序列；優(yōu)選的，所述CYP76AD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DODA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根據(jù)權利要求2所述的無損篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因之間通過DNA連接單元以任意順序連接。

4.根據(jù)權利要求2所述的無損監(jiān)測報告系統(tǒng)，其特征在于，所述DNA連接單元為能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯成一種帶有自切割功能多肽的DNA序列；

優(yōu)選的，所述DNA連接單元的核苷酸序列包含編碼SEQ ID NO.4所示2A肽氨基酸序列的DNA序列；

進一步優(yōu)選的，所述DNA連接單元為核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的2A1，或核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的2A2。

5.根據(jù)權利要求1所述的無損監(jiān)測報告系統(tǒng)，其特征在于，載體的骨架質(zhì)粒為植物載體。

6.根據(jù)權利要求1所述的無損監(jiān)測報告系統(tǒng)，其特征在于，所述終止子為能在植物中發(fā)揮功能的終止子；

優(yōu)選的，所述終止子為能在雙子葉類植物或單子葉類植物中發(fā)揮功能的終止子；

進一步優(yōu)選的，所述終止子為能在擬南芥或水稻中發(fā)揮功能的終止子；

更進一步優(yōu)選的，所述終止子為如SEQ ID NO.10所示的tHsp或如SEQ ID NO.11所示的tNOS。

7.一種監(jiān)測DNA順式元件在植物中表達模式的裸眼可視無損報告系統(tǒng)的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)提供報告基因載體的骨架質(zhì)粒，構建RUBY基因-終止子片段，將RUBY基因-終止子片段連接到所述骨架質(zhì)粒中，構建得到含有RUBY基因和終止子的載體pRUBY-終止子；

2)將待監(jiān)測的DNA順式元件連入RUBY-終止子片段之前，獲得所述無損監(jiān)測報告系統(tǒng)pDNA順式元件-RUBY-終止子。

8.根據(jù)權利要求7所述的構建方法，其特征在于，所述步驟1)的具體操作為：分別獲得CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因、終止子片段；使用體外重疊延伸PCR的方法將CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因三種DNA分子通過DNA連接單元以任意順序組合為RUBY基因，在RUBY基因之后連接終止子，獲得RUBY基因-終止子片段；將RUBY基因-終止子片段連接到所述骨架質(zhì)粒中，構建得到含有RUBY基因和終止子的載體pRUBY-終止子。

9.權利要求1所述的監(jiān)測DNA順式元件在植物中表達模式的裸眼可視無損報告系統(tǒng)或權利要求7所述的監(jiān)測DNA順式元件在植物中表達模式的裸眼可視無損報告系統(tǒng)的構建方法在監(jiān)測植物中DNA順式元件表達模式中的應用。

10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，采用所述監(jiān)測DNA順式元件在植物中表達模式的裸眼可視無損報告系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物后，直接通過裸眼觀察植物的哪些組織或者器官變成紅色，確定待監(jiān)測的DNA順式元件的在植物中表達模式。

11.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，所述DNA順式元件的表達可以發(fā)生在各類植物整體或植物的部分，

優(yōu)選的，所述植物為雙子葉類植物和/或單子葉類植物，

進一步優(yōu)選的，所述植物為擬南芥和/或水稻。