[發(fā)明專利]一種基于DNA walker的電化學生物傳感器的制備方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010929593.5
• 申請日: 2020-09-07
• 公開（公告）號: CN112280831A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設計）人: 由天艷;賈帆;劉東;孟淑云
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;G01N33/53;G01N27/327;G01N27/416
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬于生物傳感器技術領域，涉及一種基于DNA walker的電化學生物傳感器的制備方法及其應用；首先將DNA walker?AFB1適配體與發(fā)夾DNA1、發(fā)夾DNA2混合，滴加到金電極表面，反應后再滴加MCH，經(jīng)常溫孵育得到電化學生物傳感器；然后，在其表面修飾AFB1，錨定探針1、短鏈DNA1和短鏈DNA 2的混合液，浸入亞甲基藍溶液，通過測定傳感器電流值，與AFB1濃度構建得到標準曲線；最后通過測定未知樣品的電流值，代入構建的標準曲線，即可實現(xiàn)未知樣品中AFB1的檢測；本發(fā)明以極少量的目標物AFB1可以進行雙重信號放大，得到更大的亞甲基藍電化學信號，檢測選擇性好、速度快、靈敏度高。

技術領域

本發(fā)明屬于生物傳感器技術領域，具體涉及一種基于DNA walker的電化學生物傳感器的制備方法及其應用，可用于對真菌毒素黃曲霉毒素B1(AFB1)檢測。

背景技術

黃曲霉毒素(AFs)是呋喃環(huán)類毒素，廣泛存在于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，加工和運輸中。由于真菌毒素(例如AFs)具有很高的肝毒性和對人致癌性，因此被分類為I類人類致癌物。許多國家和世界組織對自動對焦提出了嚴格的要求，例如食品中AF的最大殘留限量為15ng mL^-1。其中黃曲霉毒素B1(AFB1)已被證實是極其危險的。并開發(fā)了許多公認的先進分析技術來檢測AFB1，例如高效液相色譜-熒光檢測(HPLC-FL)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。但是，這些方法操作復雜，成本高，準確性不足或受存在假陽性結果的限制。因此，開發(fā)一種高效、靈敏的電化學傳感平臺是很有必要的。

電化學方法以其簡單，快速響應和低成本等優(yōu)點而受到了廣泛的關注。已經(jīng)構建了用于靈敏檢測AF的各種電化學傳感器，例如用于AFB1分析的基于多功能DNA納米管的電化學傳感器，以及通過常規(guī)電化學方法相結合的雙模式傳感器；但是由于單信號輸出容易受環(huán)境因素的影響，而且靈敏度和精確度不足。

為了順應真菌毒素檢測更靈敏更精準的宗旨，我們構建了一種基于DNA walker這種分子步行機器實現(xiàn)電化學信號放大的適配體傳感器用于高靈敏檢測黃曲霉毒素B1。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種檢測速度快，靈敏度高的電化學檢測器件，用于直接檢測AFB1。本發(fā)明使用DNA鏈在電極表面的自組裝過程，目標物的出現(xiàn)啟動DNA鏈的自組裝行走過程，并在第一次放大的基礎上，進行雜交鏈式反應進行DNA鏈的擴增，擴增后的產(chǎn)物為長雙鏈DNA，可以吸附大量的信號分子亞甲基藍，通過交流循環(huán)伏安法進行分析檢測，獲取被兩次放大后的電化學信號，用于檢測黃曲霉毒素B1。

通過如下技術方案實現(xiàn)本發(fā)明的目的：

本發(fā)明首先提供一種基于DNA walker的電化學生物傳感器的制備方法，步驟如下：

(1)首先將DNA walker溶液和AFB1適配體溶液混合，得到的混合溶液于一定溫度的水浴條件下進行反應，水浴反應后冷卻至室溫，得到DNA walker-AFB1適配體溶液；

(2)取步驟(1)制備的DNA walker-AFB1適配體溶液與發(fā)夾DNA1溶液和發(fā)夾DNA2溶液混合，得到混合溶液，記為混合溶液A；取混合溶液A滴加到Au電極表面，固定反應一段時間；依靠DNA末端修飾的-SH，利用Au-S鍵結合作用力，將三種DNA鏈固定在電極表面；

然后再將巰基己醇(MCH)滴加到Au電極表面，常溫孵育一段時間，得到基于DNAwalker的電化學生物傳感器。

進一步地，步驟(1)中，所述DNA walker溶液的濃度為0.1μM，AFB1適配體溶液的濃度為0.15μM；所述水浴條件的溫度為90-95℃，反應時間為5min。

進一步地，步驟(2)中，所述混合溶液A中DNA walker-AFB1的最終濃度為0.1μM，發(fā)夾DNA1的最終濃度為0.5-10μM、發(fā)夾DNA2的最終濃度為0.5-10μM。