[發明專利]一種牙髓組織間充質干細胞的消化分離方法

在審

• 申請號: 202010925856.5
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112029715A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 牟浩;劉立劍;張珺
• 申請（專利權）人: 中康再生醫學科技（海南）有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種牙髓組織間充質干細胞的消化分離方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1)獲取牙髓組織；步驟2)分離培養牙髓組織間充質干細胞；步驟2.1)用眼科剪將步驟1獲得的牙髓組織剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小塊，加入1～3mg/ml的I型膠原酶、2～5mg/ml的中性蛋白酶和0.5～2mg/ml的胰酶，37℃中消化8～12min使牙髓組織松散。本發明的牙髓組織間充質干細胞增殖穩定性好，增殖數量大。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種牙髓組織間充質干細胞的消化分離方法。

背景技術

間充質干細胞具有多向分化潛能，可以修復損傷或缺失的組織，具有很大的臨床應用潛力。牙髓干細胞屬于間充質干細胞，而且是活性最強的間充質干細胞，活性是骨髓干細胞的3倍。少量牙髓干細胞就能分裂出千千萬萬細胞。分化能力非常強，在合適的體內或體外環境下可以分化成為骨細胞、脂肪細胞以及肝細胞等多種人體細胞，為組織、器官修復和移植提供了新的細胞來源。為深受疾病困擾的人們帶來新的希望，并隨著疾病研究范圍擴大，將來糖尿病，脊髓損傷，中風，心臟瓣膜病，牙周病等都有望利用牙髓干細胞得到治療。

目前，體外大規模的長期擴增培養是牙間充質干細胞臨床應用的前提。然而，常規條件培養出的人牙髓干細胞貼壁慢、生長慢、細胞增殖能力下降、細胞衰老、干細胞特性降低、細胞分化能力減弱等缺陷。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種牙髓組織間充質干細胞的消化分離方法，該消化分離方法，牙髓組織間充質干細胞增殖能力高、更容易獲得單一、純化的大量原代細胞。

為實現上述目的，本發明實施例所采用的技術方案如下：

步驟1)獲取牙髓組織；

步驟2)分離培養牙髓組織間充質干細胞；

步驟2.1)用眼科剪將步驟1獲得的牙髓組織剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小塊，加入1～3mg/ml的I型膠原酶、2～5mg/ml的中性蛋白酶和0.5～2mg/ml的胰酶，37℃中消化8～12min使牙髓組織松散；

步驟2.2)將步驟2.1中松散的牙髓組織，500r/min～700r/min，離心8～10min，棄上清液，加入培養液終止消化，吹打離散單細胞團塊，形成的單細胞懸液，將單細胞懸液通過孔徑為70μm的細胞篩網過濾；

步驟2.3)將步驟2.2)過濾后的單細胞懸液，800r/min～1000r/min，離心4～5min，棄上清液，用培養液將細胞重懸；

步驟2.4)將步驟2.3)中重懸后的細胞以1×103～2×103個/ml接種于培養液中，放于37℃、濕度為95％的二氧化碳培養箱中培養24h，2～4天后半量換液，以后隔天換液。

進一步地，所述步驟2)分離培養牙髓組織間充質干細胞還包括：

步驟2.5)當細胞生長至80％～90％匯合時，用培養液傳代培養。

進一步地，所述培養液為無血清培養液，包括表皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子-4、神經肽Y以及MEM培養基。

進一步地，所述無血清培養液中：表皮細胞生長因子的含量為100～250μg/L，血小板衍生生長因子的含量為300～600μg/L，肝細胞生長因子的含量為8～12μg/L，成纖維細胞生長因子-4的含量為10～15μg/L，神經肽Y的含量為15～20ng/L，以及地塞米松1～15mM的MEM培養基。

進一步地，所述無血清培養液中：表皮細胞生長因子的含量為200μg/L，血小板衍生生長因子的含量為500μg/L，肝細胞生長因子的含量為10μg/L，成纖維細胞生長因子-4的含量為10μg/L，神經肽Y的含量為15ng/L，以及地塞米松5mM的MEM培養基。