[發明專利]一種丙環唑半抗原、完全抗原和其抗體及其制備和應用

有效

• 申請號: 202010925563.7
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112225725B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 沈興;陳博;雷紅濤;李向梅;陳佳虹;王錦;徐振林;楊金易;沈玉棟;孫遠明
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C07D405/06
• 分類號: C07D405/06;C07K14/765;C07K14/795;C07K16/06;C07K16/44;G01N33/53;G01N33/543;G01N33/558;G01N33/58
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發明公開了一種丙環唑半抗原、完全抗原和其抗體及其制備和應用。本發明首先制備得到了一種丙環唑半抗原，應用該半抗原制備得到了丙環唑完全抗原和多克隆抗體，該抗體對丙環唑具有高靈敏度和高特異性的識別能力，半抑制濃度為4.23ng/mL，定量檢測范圍為0.29～61.83ng/mL，檢測限為0.06ng/mL，對乙環唑、三唑醇和己唑醇等類似物交叉反應率均低于1％，為建立特異性丙環唑的免疫檢測方法提供了核心原材料；此外，利用該多克隆抗體建立了檢測丙環唑殘留的酶聯免疫試劑盒和膠體金試紙條，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點，能夠特異性的檢測樣品中的丙環唑殘留。

技術領域

本發明屬于食品安全檢測技術領域。更具體地，涉及一種丙環唑半抗原、完全抗原和其抗體及其制備和應用。

背景技術

丙環唑是一種既有保護作用又有治療作用的內吸性三唑類殺菌劑，可被根莖葉部吸收，并很快地在植物體內向上傳導。其作用機理是影響甾醇的生物合成，使病原菌的細胞膜功能受到破壞，最終導致細胞死亡，從而起到殺菌、防病和治病的功效。經查詢中國農藥信息網，丙環唑在我國登記的作物主要有水稻、小麥、玉米、大豆、油菜、馬鈴薯、茭白、蓮藕、枇杷、花生、蘋果、香蕉、榛子和人參等。殘效期在1個月左右，一般只對皮膚和眼有刺激作用，經口誤服，可引起惡心、嘔吐等。由于其毒負作用，國內國際上均對其殘留限量做出了限定。目前歐盟等國家對不同作物中的丙環唑殘留量做出了詳細的限量，日本肯定列表中規定丙環唑在菜心、芥藍和小白菜上的最大允許殘留限量(MRL值)為0.05mg/kg。中國在GB2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定各類食品中最大允許殘留限量(MRL值)為0.02mg/kg。因此，為了公眾的健康，對食品中丙環唑殘留量的檢測是十分必要的。

有關丙環唑在蔬菜、水果、糧食、食品中的殘留分析方法國內外已有一些報道。目前，對于丙環唑殘留的檢測方法主要有高效液相色譜(High Performance LiquidChromatography，HPLC)、氣相色譜(Gas Chromatography，GC)、氣相色譜-質譜聯用(GasChromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)以及高效液相-質譜聯用(High PerformanceLiquid Chromatography-Mass Spectrometer，HPLC-MS)等方法。這些方法結果可靠，靈敏度高，已有相關的技術標準可供參考。但由于需要昂貴的儀器、專門的操作人員，以及樣品前處理復雜、有機溶劑使用量大等，因此該方法一方面不能實現現場的快速檢測；另一方面也很難在我國基層單位廣泛推廣。

與儀器分析方法相比，免疫檢測方法因其簡便、經濟、快速等優點而在農藥殘留檢測領域中受到越來越多的關注。ELISA方法是常用的免疫檢測方法，但是其卻有操作步驟相對較多，檢測時間較長，檢測結果不夠直觀等缺陷。因而ELISA在丙環唑農藥的快速檢測上的應用受到很大的限制。

膠體金試紙條無需專業操作人員及任何輔助類儀器，根據反應所顯現的條帶幾分鐘即可判定結果，不僅操作簡便、快速，且結果直觀準確、成本低。而在建立能夠高效、特異性檢測丙環唑的免疫學檢測方法時，關鍵在于獲得靈敏度高、特異性強的抗體，如公開號為CN106596953A的中國專利提供了一種檢測丙環唑的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，是在丙環唑結構上進行改造、修飾，來合成半抗原，偶聯蛋白來免疫動物，但這樣會破壞丙環唑的結構，導致很難產生針對丙環唑的特異性抗體。因此，迫切需要提供一種保留丙環唑整體結構并且能夠產生針對丙環唑特異性高的抗體的半抗原和抗原，同時建立一種檢測高效、靈敏、特異性強、能專一檢測丙環唑的免疫學檢測方法。

發明內容