[發(fā)明專利]一種單鼠李糖脂生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010924366.3
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112725252A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳玲;汪江林
• 申請（專利權(quán)）人: 上海恒什生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N1/20;C12P19/44;C12R1/385
• 代理公司: 上?？坡蓪＠硎聞?wù)所(特殊普通合伙) 31290
• 代理人: 葉鳳

本發(fā)明一種單鼠李糖脂生產(chǎn)菌株及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以銅綠假單胞菌PAO1菌株作為出發(fā)菌株，利用同源重組的方法將其自身的rhlC基因替換為rhlAB?R基因簇，獲得了一株能夠?qū)Ｒ恍陨a(chǎn)單鼠李糖脂的銅綠假單胞菌菌株；進(jìn)一步結(jié)合隨機誘變，篩選出一株單鼠李糖脂生產(chǎn)水平顯著提高的突變菌株。該突變菌株利用市售的金龍魚葵花籽油作為底物，在5L的生物反應(yīng)器中，于37℃發(fā)酵90小時，單鼠李糖脂的濃度達(dá)到62.7g/L，純度達(dá)到95.16％，其中Rha?C₁₀?C₁₀的比例最大，占比為68.59％。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】

鼠李糖脂是由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或者伯克氏菌(Burkholderia)分泌的一類表面活性分子，屬于生物表面活性劑。它具備生物 可降解、低毒性、在極端環(huán)境下仍有效等的特性。另外，還具備抑制微生物、 皮膚相容性以及螯合重金屬離子處理重金屬污染、促進(jìn)微溶性的有機化合物的 溶解和生物降解。鼠李糖脂的這些特性使得它能夠廣泛應(yīng)用于生物防治、化妝 品、醫(yī)藥、洗滌劑、環(huán)境清潔以及是由開采等領(lǐng)域。

通常表說的“鼠李糖脂”不是一種單一的結(jié)構(gòu)體，而是由很多種同族結(jié)構(gòu) 組成的混合物，在已知的報道中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多達(dá)28種不同結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂結(jié)構(gòu)。 其具備一般表面活性劑的基本特征，其親水基團(tuán)一般由1～2分子的鼠李糖環(huán)構(gòu) 成，疏水基團(tuán)則由1～2分子具有不同碳鏈長度的飽和或不飽和脂肪酸構(gòu)成。銅 綠假單胞菌分泌的鼠李糖脂的脂鏈一般包括兩個鏈長相同的羥基脂肪酸鏈，結(jié) 構(gòu)可以表示為Rha-C₁₀-C₁₀和Rha-Rha-C₁₀-C₁₀。而不同結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂同系物的 分布成為了限制鼠李糖脂商品化的一個主要問題。這是由于不同結(jié)構(gòu)的鼠李糖 脂具備不同的溶解性以及表面活性，從而會影響鼠李糖脂產(chǎn)品的物理化學(xué)性質(zhì) 以及產(chǎn)品在高端領(lǐng)域的應(yīng)用。

為了提高鼠李糖脂在高端領(lǐng)域的應(yīng)用價值，往往需要對發(fā)酵液中的鼠李糖 脂產(chǎn)品進(jìn)行多級的純化，已有的數(shù)據(jù)表明，后期純化鼠李糖脂的成本占到總成 本的75％左右。因此，一般通過化學(xué)合成工藝制備純度較高的同種鼠李糖脂， 例如GlycoSurf公司使用化學(xué)方法生產(chǎn)的鼠李糖脂，原料為鼠李糖，他們可以 利用鼠李糖生產(chǎn)多種鼠李糖脂，從而能夠更好地滿足客戶需求，還減少了發(fā)酵 和分離過程的成本，得到更高的產(chǎn)量。但化學(xué)合成工藝復(fù)雜，成本居高不下。

雖然早在1980年，研究人員就從外耳感染病人中分離出了一株銅綠假單胞 菌ATCC 9027(DSM 1128)，可以專一的生產(chǎn)單鼠李糖脂，但在37℃條件下，其 生產(chǎn)的單鼠李糖脂水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于銅綠假單胞菌PAO1菌株(Complete genome sequence of Pseudomonasaeruginosa PAO1,an opportunistic pathogen. Nature 2000,406:959-964.)；盡管在小鼠模型中，研究人員驗證了 ATCC9027菌株不存在感染性，但在30℃條件下，ATCC9027菌株生產(chǎn)的綠膿菌 素水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PAO1菌株，這仍然是一個不容忽視的問題；這些問題都大大限 制ATCC9027菌株的應(yīng)用(María-Victoria Grosso-Becerra et al., Pseudomonasaeruginosa ATCC 9027is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipidsproduction)。