[發明專利]一種基于單核苷酸分子對接的核酸適配體設計方法

有效

• 申請號: 202010924315.0
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112210587B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 黃強;宋夢華;劉建平;顏志超;李園園
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811;C12N15/115
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.一種基于單核苷酸分子對接的核酸適配體設計方法，其特征在于，具體步驟為：

第一步：進行單核苷酸水合對接，獲得結合在靶標小分子表面的單核苷酸位置；

其中，水合對接所用軟件為AutoDock分子對接軟件包，受體分子為靶標小分子，配體分子為各核苷酸(A,C,G,T)；分子對接采用的算法為拉馬克遺傳算法(LGA)，該算法將遺傳算法和局部搜索結合在一起，遺傳算法用于全局搜索，局部搜索用于能量優化；對接方法采用的是半柔性對接，即在對接過程中，靶標小分子的構象不發生變化，而各核苷酸的構象在一定的范圍內變化；為了增加分子對接的準確性，在對接過程中考慮水的作用，因此所用力場為具有離散可置換水和去溶劑熵的水合對接力場；為了確保核苷酸能夠充分搜索構象，將對接格子的長寬高均設置為100 ?；格點之間的間隔為0.375 ?，對接格子的中心為靶標小分子的幾何中心；

第二步：組裝離散的核苷酸，獲得與靶標小分子結合的核酸短鏈；

由第一步的水合對接，獲得了與靶標小分子結合的核苷酸，這些核苷酸呈離散狀分布在小分子的周圍；通過核苷酸之間的距離關系，將離散的核苷酸組裝成為核酸短鏈，為獲得完整的核酸適配體奠定基礎；具體做法為：

在標準的DNA鏈中，核苷酸的原子C-3’與相鄰核苷酸的原子C-4’之間的距離為5 ?，或者核苷酸的原子C-4’與相鄰核苷酸的原子C-3’之間的距離為5 ?，采用此距離作為標準，通過測量核苷酸間C-3’和C-4’原子之間的距離，確定相鄰的核苷酸；同時最大限度地將離散的核苷酸組裝在一起，最終組裝成為多條孤立的核酸短鏈；

為了使核酸短鏈的結構合理化，將對核酸短鏈進行能量最小化；在此過程中，將固定其側鏈原子，只移動主鏈上原子；能量最小化采用GROMACS-5.1.4分子動力學軟件包，AMBER99bsc1力場及SPC水模型對核酸短鏈系統進行建模；在模擬系統中，核酸短鏈置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距離為10 ?；并且插入金屬陽離子和相應的陰離子使溶液環境保持中性，并達到所需的離子濃度；最后使用最速下降法進行能量最小化，得到結構合理化的核酸短鏈；

第三步：進行分子動力學模擬，獲取核酸短鏈-靶標小分子復合物的穩定構象；

在上一步獲得結構合理化的核酸短鏈后，將核酸短鏈及靶標小分子作為整體，進行分子動力學模擬，以獲得穩定的復合物構象；其中，靶標小分子的通用AMBER力場參數采用AmberTools自帶的Antechamber軟件包生成；同時采用GROMACS-5.1.4分子動力學軟件包，AMBER99bsc1力場及SPC水模型對模擬體系進行建模；在模擬系統中，多條核酸短鏈作為整體置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距離為10 ?；為了與溶液環境保持一致，將插入金屬陽離子和相應的陰離子使溶液環境保持中性，并達到所需的離子濃度；模擬過程采用周期性邊界條件，靜電和范德華相互作用分別采用PME和Cut-off方法計算，截斷距離均為14 ?；所有化學鍵均受LINCS算法約束；其中，積分時間步長為1~3 fs；具體過程為：首先利用最陡下降算法對模擬系統進行能量最小化；然后采用v-rescale恒溫器控制系統平衡溫度，berendsen壓力耦合平衡壓強；最后，在md集成器中對體系進行時間長度不少于50 ns分子動力學模擬；

第四步：采用mini-hairpin結構將核酸短鏈組裝為完整的核酸適配體；

在獲得與靶標小分子穩定結合的核酸短鏈構象后，采用mini-hairpin結構作為連接組分，將孤立的核酸短鏈組裝成為完整的核酸適配體；Mini-hairpin的莖狀結構含為3~4對互補的堿基對，環狀結構含有3~4個孤立的堿基；Mini-hairpin的3D結構通過Rosetta程序中的RNA 3D structure modeling模塊獲得；為獲得結構合理的核酸適配體，將進行能量最小化，在此過程中，將固定核酸短鏈上的原子，僅移動mini-hairpin上的原子；

第五步：進行分子動力學模擬，獲得核酸適配體-靶標小分子復合物的穩定構象；

獲得完整的核酸適配體后，將核酸適配體及靶標小分子作為整體，進行分子動力學模擬，獲得穩定的復合物構象；其中，靶標小分子的通用AMBER力場參數采用AmberTools自帶的Antechamber軟件包生成；模擬體系采用GROMACS-5.1.4分子動力學軟件包，AMBER99bsc1力場及SPC水模型進行建模；在模擬系統中，核酸適配體置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距離為15 ?；為了與溶液環境保持一致，將插入金屬陽離子和相應的陰離子使溶液環境保持中性，并達到所需的離子濃度；模擬過程采用周期性邊界條件；靜電和范德華相互作用分別采用PME和Cut-off方法計算，截斷距離均為14 ?；所有化學鍵均受LINCS算法約束；其中，積分時間步長為1~3 fs；通過v-rescale和berendsen耦合維持體系的溫度和壓強，最后對體系進行時間長度不少于100 ns的分子動力學模擬；

第六步：采用微量熱泳動方法MST實驗檢測核酸適配體與靶標小分子的結合強度；

對于每一組MST實驗，設計16個靶標小分子的濃度用于16根毛細管，利用梯度稀釋法1:1稀釋靶標小分子，其中每根毛細管中核酸適配體的濃度固定；熒光標記于核酸適配體mini-hairpin的環狀結構上；核酸適配體與靶標小分子的偶聯會影響熱泳動的過程，由此導致熱泳動之后熒光信號值的變化；通過測量在不同結合程度下，樣品溶液MST過程熒光變化信號，可以擬合得到關于該結合反應解離平衡常數K_d值；

其中，所述靶標小分子為岡田酸(OA)；設計得到核酸適配體，記為OA-D1，其序列為。