[發明專利]一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法

在審

• 申請號: 202010918773.3
• 申請日: 2020-09-04
• 公開（公告）號: CN112126679A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 李紅亮;張籍;吳帆
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于包括以下工藝步驟：

1）根據枇杷18S RNA的ITS序列，設計了特異寡核苷酸引物和TaqMan探針；

2）利用改進的CTAB法提取枇杷蜜中植物源（枇杷花粉）的DNA成分；

3）利用步驟1的寡核苷酸引物和TaqMan探針，以及步驟2中的提取的DNA成分，設計熒光定量PCR方法，進行擴增，記錄Ct值數據；

4）基于步驟3的Ct值數據匯合步驟2的DNA提取結果對檢測樣品進行判定。

2.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于，步驟1中ITS序列為枇杷Eriobotrya japonica的18S RNA，全長681bp,Genbank注冊號為KJ170761~KJ170775。

3.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于，步驟1中寡核苷酸引物，上游序列為5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’；下游序列為5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’，擴增長度為212 bp；擴增序列位于枇杷18SRNA中第96至307bp范圍。

4.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于，步驟1中TaqMan探針序列為FAM-5’-CGTATTGCGCCAAGGAACTCGAACGAAAGAG-3’-TAMRA，其中FAM為報告熒光基團，TAMRA為淬滅熒光基團；TaqMan探針序列位于寡核苷酸上游引物下游40bp處，及寡核苷酸下游引物的上游101bp處。

5.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于，步驟2中枇杷蜜中的DNA提取采用改進后的CTAB法，20 mL蜂蜜樣品中提取DNA濃度為10~500 ng/μL。

6.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于，步驟3中設計的熒光定量方法中反應體系為20μL，其中Premix ExTaq (2×)為10 μL；PCR上游和下游引物(10 μM)均為0.4 μL；TaqMan探針為0.8 μL；DNA模板為2 μL（20~50 ng），滅菌水為6.4 μL。

7.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于，步驟3中設計的熒光定量方法中第一步95℃ 20秒，1個循環；第二步95℃ 1秒，60℃ 20秒，40個循環數，激發波長為494nm，記錄波長為522nm。

8.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于，步驟4中當循環閾值Ct值界于26.9~31.2時被認為枇杷蜜中具有合理的枇杷植物源成分。

9.根據權利要求1所述的一種基于植物花粉DNA提取和熒光定量的天然枇杷蜜檢測和判定方法，其特征在于所述步驟4中，以20 mL蜂蜜提取的50ng DNA為模板，若Ct值 34，則判定為濃縮摻雜蜜，此時提取的DNA濃度越高，混摻雜蜜越多，反之摻入濃縮或假蜜越多；若提取DNA濃度10 ng/μL，或DNA濃度極低或Ct 值34，均被判定為濃縮或摻假蜜。