[發(fā)明專利]一種煙草鐮刀菌致病性快速鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010914669.7
• 申請(qǐng)日: 2020-09-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112119895A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邱睿;李娟;蘇新宏;鄭文明;董寧宇;張盈盈;李琦;徐敏;李淑君;李成軍;陳玉國(guó);李小杰;白靜科;趙均
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所
• 主分類號(hào): A01G31/00
• 分類號(hào): A01G31/00;A01G7/06
• 代理公司: 鄭州意創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 41138
• 代理人: 張江森;張燕紅

本發(fā)明涉及煙草病害鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草鐮刀菌致病性快速鑒定方法，步驟一、加熱，打孔，步驟二、將真葉用無(wú)菌水沖洗干凈，步驟三、加無(wú)菌水混合，步驟四、蓋上蓋子，步驟五、觀察，記錄，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：1.該發(fā)明所用的鐮刀菌粗毒素制備方法已經(jīng)非常成熟，制備鐮刀菌粗毒素的培養(yǎng)基材料便宜，制備方法簡(jiǎn)單，2.該發(fā)明中使用的培養(yǎng)皿為透明材質(zhì)，容易觀察煙株根部癥狀，3.該發(fā)明所述的試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易操作，不需要特殊培訓(xùn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及煙草病害鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草鐮刀菌致病性快速鑒定方法。

背景技術(shù)

鐮刀菌屬不全菌綱，叢梗孢目，瘤痤孢科，鐮刀菌屬，廣布自然界，有些引起小麥、水稻和蔬菜的病害；有些對(duì)工農(nóng)業(yè)有利，如赤霉素(920)就是從念珠鐮刀菌產(chǎn)生的；有些引起人和動(dòng)物的真菌病，如茄鐮刀菌(F. solani)可引起角膜潰瘍，有時(shí)侵犯皮膚和指甲，甚至中毒(鐮刀菌毒素)，在分類學(xué)上，鐮刀菌無(wú)性時(shí)期原屬于半知菌亞門，有性時(shí)期為子囊菌亞門。根據(jù)《菌物詞典》2001年第9版，鐮刀菌屬于無(wú)性真菌類，有性時(shí)期為子囊菌門，自從1809年Link首先在錦葵科植物上發(fā)現(xiàn)第一株鐮刀菌，定名粉紅鐮刀菌以來(lái)，鐮刀菌的種類已發(fā)現(xiàn)44種和7個(gè)變種左右，它們分布極廣，普遍存在于土壤及動(dòng)植物有機(jī)體上，甚至存在于嚴(yán)寒的北極和干旱炎熱的沙漠，屬于兼寄生或腐生生活。

鐮刀菌引起的煙草根腐病是煙葉生產(chǎn)中的一種重要根莖類病害，該病害的典型癥狀表現(xiàn)為患病煙株生長(zhǎng)衰弱、煙葉由下往上逐步變黃萎蔫、煙株莖基部出現(xiàn)壞死斑、主根出現(xiàn)水漬狀褐色壞死，剖開(kāi)病莖、病根，可觀察到木質(zhì)部褐變，嚴(yán)重時(shí)煙株死亡，鐮刀菌分布極廣，普遍存在與土壤及動(dòng)植物有機(jī)體上，煙田中，很多鐮刀菌作為腐生菌附著在煙株根莖部位，科技工作者從煙田帶回的病株上，分離出的鐮刀菌很大一批是非致病的腐生鐮刀菌，對(duì)大批量的菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，篩選強(qiáng)致病菌株是一項(xiàng)必要的基礎(chǔ)工作，目前常用的致病性測(cè)定方法如孢子懸浮液浸根法、孢子懸浮液灌根法、接谷法等都比較費(fèi)時(shí)，而且環(huán)境因素影響比較大，重復(fù)性差，給后期深入研究科研帶來(lái)很大麻煩，目前煙草鐮刀菌致病性測(cè)定方法鑒定周期長(zhǎng)、重復(fù)性差，根部癥狀不易觀察。

因此，生產(chǎn)一種快速鑒定煙草鐮刀菌致病性的方法，該方法能快速有效檢測(cè)煙草鐮刀菌根腐病菌對(duì)煙株的致病性，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，為快速篩選煙草強(qiáng)制病菌株及煙草鐮刀菌根腐病抗性材料選育等深入研究提供技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)快速鑒定煙草鐮刀菌致病性的方法，本發(fā)明提供一種能快速有效檢測(cè)煙草鐮刀菌根腐病菌對(duì)煙株的致病性，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，為快速篩選煙草強(qiáng)制病菌株及煙草鐮刀菌根腐病抗性材料選育等深入研究提供技術(shù)支撐。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種煙草鐮刀菌致病性快速鑒定方法，包括以下步驟：

步驟一、將直徑為7mm的打孔器燒熱，在直徑為9cm無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿蓋上打孔；

步驟二、將培養(yǎng)至4-5片真葉生長(zhǎng)一致健苗根部基質(zhì)用無(wú)菌水沖洗干凈；

步驟三、將根部從培養(yǎng)皿蓋孔穿過(guò)，向培養(yǎng)皿中加入10mL煙草鐮刀菌粗毒素原液和10mL無(wú)菌水，混勻配置成1/2粗毒素液；

步驟四、將裝有煙苗的培養(yǎng)皿蓋蓋上，讓煙苗根部浸入到1/2粗毒素液體中；

步驟五、重復(fù)步驟一至步驟四，重復(fù)數(shù)量為20次，采用無(wú)菌水為對(duì)照，置于25℃、D:L=16:8光照培養(yǎng)架上連續(xù)觀察4到7d，觀察煙株根部及葉片變化。

煙草鐮刀菌粗毒素原液制作方法為：

從生長(zhǎng)旺盛的純化菌株P(guān)DA平板上的邊緣部位打取4-5塊直徑為4mm菌餅，將打取下來(lái)的菌餅轉(zhuǎn)接至裝有200mL滅菌PDB培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在25度的溫度下，采用180轉(zhuǎn)/分鐘的最高轉(zhuǎn)速搖菌3到5天，采用無(wú)菌雙層紗布過(guò)濾去除菌絲，濾液8000rpm離心5min，121℃高壓滅菌20min。