[發明專利]一種單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法

在審

• 申請號: 202010911310.4
• 申請日: 2020-09-02
• 公開（公告）號: CN112129870A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 曹希文;肖漢族;周志恒;王芳;王均云;陽希;廖應龍
• 申請（專利權）人: 南岳生物制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

1.一種單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法，其特征在于，所述單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法包括以下步驟：

步驟一，稱取待分析單克隆抗體藥物，配制原料藥溶液；所述待分析單克隆抗體藥物為生物靶向藥物；

步驟二，使用溶劑將原料藥溶液分別稀釋成不同濃度，并將五份不同濃度的溶液作為系列標準溶液，以原料藥溶液的總濃度作為標示量，計量各標準溶液中各組分的相對濃度；

所述系列標準溶液的濃度分別為10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L；

步驟三，經灌胃或靜脈注射的方式給予健康受試動物由步驟二制備的溶液，收集動物血液樣品于聚乙烯管中，并進行血液樣品的處理得到血漿樣品；使用血漿樣品和系列標準溶液制成相應的血漿溶液；

所述健康受試動物為質量為200±10g的雄性Wistar大鼠，在進行灌胃或靜脈注射前，對其進行10-15天培養，具體培養條件為：設定培養室的溫度為20-25℃，培養濕度為45-60％，并且培養室中光照為12h明暗交替；

所述收集動物血液樣品于聚乙烯管中，并進行血液樣品的處理，具體包括：

分別于給藥后的0.25h、0.5h、1h、2h、4h、12h、24h對健康受試動物的血液進行采集，經眼球后靜脈叢取300-500μL靜脈血，即血液樣品；

吸取血液樣品于加有乙二胺四乙酸二鈉抗凝的離心管中，靜置20min，然后在4℃環境下進行10-12min離心，離心轉速為3000rpm，分離血漿，得到血漿樣品；

所述使用血漿樣品和系列標準溶液制成相應的血漿溶液，具體為：

分別取不同濃度的系列標準溶液100μL置于離心管中，分別置于氮吹儀中水浴40℃吹干；

吹干后加入血漿樣品100μL，渦旋混合1min，依次加入10μL內標工作液、300μL甲醇，混合均勻，置于高速離心機中12000rpm離心5min得到上清液；

上清液置于離心管中，置于氮吹儀中水浴40℃吹干，在吹干的殘渣中加入200μL甲醇復溶，渦旋30s，再次離心得到上清液，即血漿溶液；

步驟四，于步驟三得到的血漿溶液中加入0.5～0.75mg固體半胱氨酸封閉劑，渦流混勻，進行半胱氨酸的封閉處理，得到反應液；

步驟五，經半胱氨酸封閉的反應液中加入500～700μL消化緩沖液，渦流混合，再加入3μL胰酶溶液，渦流混合，孵育得到血漿樣品酶解液；

步驟六，于酶解液中加入10～15μL穩定同位素標記的特征肽段和內標肽段，渦流混勻，將所述特征肽段和所述內標肽段混合酶解；

步驟七，使用液相色譜串聯質譜儀將酶解后的反應液進行液相色譜-質譜分析，將所選的特征性肽段峰面積與內標肽段峰面積比值代入標準曲線，得單克隆抗體藥物濃度。

2.如權利要求1所述的單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法，其特征在于，步驟二中，所述溶劑為色譜純甲醇。

3.如權利要求1所述的單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法，其特征在于，步驟三中，所述實驗動物為小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬。

4.如權利要求1所述的單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法，其特征在于，步驟四中，所述進行半胱氨酸封閉處理的條件為：于25～27℃避光孵育40～45min。

5.如權利要求1所述的單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法，其特征在于，步驟五中，所述酶解方法為：使用胰蛋白酶酶切處理；所述酶解過程中添加BSA，所述BSA的質量體積百分數為1～1.5％。

6.如權利要求1所述的單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法，其特征在于，步驟五中，所述孵育方法為：于37℃孵育12～16h得到血漿樣品酶解液，加入3～5μL甲酸終止反應。

7.如權利要求1所述的單克隆抗體藥物的藥代動力學質譜分析方法，其特征在于，步驟六中，所述特征肽段和內標肽段所含的穩定同位素標記是針對所述特征肽段和內標肽段中的脯氨酸的N和C元素分別進行¹⁵N和¹³C標記。