[發明專利]一種穩定高表達蛋白的單拷貝細胞株的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202010909945.0
• 申請日: 2020-09-02
• 公開（公告）號: CN112175993B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 杭海英;蔣薇;趙云;安莉莉
• 申請（專利權）人: 海珂分子（北京）科技有限責任公司;中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10;G01N15/14
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

1.一種穩定高表達蛋白的單拷貝細胞株的構建方法，其特征在于，所述方法基于293T細胞的可以快速精確插入且能穩定高水平表達目的基因；所述方法包括如下步驟：

(1)通過將含有可替換基因盒的anti-TNFα抗體表達質粒隨機整合至293T細胞的基因組中，流式分選富集獲得穩定高水平表達anti-TNFα單鏈抗體的293T-anti-TNF細胞；

(2)轉染pFRT-EGFP-LoxP替換質粒pCDFGL替換展示在細胞膜表面的anti-TNFα單鏈抗體基因，第一輪重組替換，即Replace 1；替換成功的細胞會表達GFP從而自發綠色熒光，經過多輪的流式分選富集只表達GFP的細胞，命名為293T-GFP；

(3)用pFRT-RFP-LoxP替換質粒pFRL去替換細胞中的GFP基因，第二輪重組替換，即Replace2；多輪的流式分選富集只表達RFP的細胞，命名為293T-RFP；

(4)利用96孔板單細胞分選篩選出穩定高表達蛋白的優異單細胞克隆；

(5)獲得優異克隆后，基于細胞株插入基因框的可替換性，將攜帶有外源基因的替換質粒pFRT-Ab-LoxP等準確插入到基因框中進而穩定表達目標蛋白進行后續研究，第三輪重組替換，即Replace 3；

在步驟(1)中，轉染pCDNA3.1-hygro-SV40-DHFR-SV40 polyA-FRT-TNF-Loxp表達質粒pCD至前一天種下的293T細胞中；第二天加入100μg/mL濃度的hygromysin B抗生素篩選一周，然后在不含有hygromycin抗生素的培養基中培養一段時間使其穩定生長；未成功轉染質粒的293T陰性細胞因為不具有hygromysin B抗性在抗生素篩選下逐漸死亡，加壓后存活下來的細胞因成功轉染質粒其細胞膜上有大量anti-TNFα單鏈抗體分子的表達，穩定培養一段時間后通過流式細胞儀將穩定高水平表達抗體分子的細胞群體分選下來，命名為293T-anti-TNF細胞，用于后續的多輪重組替換以增加獲得單拷貝細胞株的機率；

在步驟(2)中，將pFRT-EGFP-LoxP替換質粒pCDFGL和重組酶質粒pF2AC共轉293T-anti-TNF細胞，在Flp和Cre酶的共同作用下使GFP基因替換細胞中的anti-TNFα抗體基因；替換成功的細胞轉錄表達GFP蛋白，從而自發綠色熒光；流式分選只表達GFP熒光的細胞，命名為293T-GFP；將分選回來的293T-GFP細胞在無抗生素壓力下經長時間擴大培養后繼續進行了兩輪流式分選，每輪分選富集0.5％的GFP熒光最強的細胞，直至檢測不到標記anti-TNFα抗體的熒光信號，目的是獲得蛋白表達水平更高且表達更為穩定均一的優勢細胞群體；

在步驟(3)中，將pFRT-RFP-LoxP替換質粒pFRL和重組酶質粒pF2AC共轉293T-GFP細胞，在Flp和Cre酶的共同作用下RFP基因替換掉細胞中的GFP；替換成功的細胞轉錄表達RFP蛋白使得細胞自發紅色熒光；流式分選富集只有RFP熒光的細胞，命名為293T-RFP；將分選回來的293T-RFP細胞在無抗生素壓力下經長時間擴大培養后繼續進行了兩輪流式分選，每輪分選富集0.5％的RFP熒光最強的細胞，直至檢測不到GFP熒光信號；在步驟(4)中，通過兩輪的流式分選富集最強RFP熒光信號后，進行96孔板單細胞分選，每個孔僅分選一個細胞，一共分了3個96孔板；待96孔板中的細胞培養生長一周后，顯微鏡下逐個觀察將孔中有多個細胞克隆生長，或沒有分選到細胞的孔，或單克隆細胞生長狀態不好的排除在外，剩下生長狀態良好的單克隆細胞株存活進行編號；待上述單克隆細胞株培養擴增后，流式檢測每個單克隆表達RFP信號的均一度和穩定性，從中挑選出排名靠前的數個單克隆細胞株進行后續實驗；

在步驟(5)中，將pFRT-外源蛋白-loxP替換質粒和pF2AC重組酶質粒共轉上述步驟獲得的單克隆細胞株，在重組酶的作用下細胞中的RFP被外源基因替換；流式分選細胞表面展示有外源蛋白的293T單克隆細胞；

所述外源蛋白為ADORA2A蛋白，所述ADORA2A蛋白為包含有信號肽、FLAG標簽和跨膜序列的重組基因SP-ADORA2A-FLAGTM所編碼的蛋白。

2.根據權利要求1所述方法制備和篩選的穩定高表達蛋白的單拷貝細胞株，所述單拷貝細胞株為權利要求1的步驟(4)得到的單拷貝細胞。

3.權利要求2所述的穩定高表達蛋白的單拷貝細胞株在重組蛋白表達中的應用。