[發(fā)明專利]一種維持細(xì)胞表型的三維擴(kuò)增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010908985.3
• 申請日: 2020-09-02
• 公開（公告）號: CN111979180A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 路堯;王詳
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州優(yōu)渡生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C07K16/40;C07K19/00
• 代理公司: 杭州橙知果專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33261
• 代理人: 李品

1.一種維持細(xì)胞表型的三維擴(kuò)增方法，其特征在于，所述方法包括以接種量1×10⁴個/ml將肝干細(xì)胞接種于殼聚糖多孔凝膠中，置于培養(yǎng)基中，使多孔凝膠與培養(yǎng)基的體積比為2:5，在37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO₂的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)3周，每五天分別更換新鮮培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含終濃度為3.5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、5μg/L轉(zhuǎn)化生長因子FGF9、0.15μmol/L地塞米松、2.0mg/L煙酸肌醇酯、0.48mg/L裝載有hsa-miR-156a的載體、成纖維細(xì)胞生長因子20mg/L、人源化PI3K單抗20mg/L、DMEM培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)為8.5％的胎牛血清。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述人源化PI3K單抗為氨基酸序列如SEQ IDNO:01所示的CDR-L1，氨基酸序列如SEQ ID NO:02所示的CDR-L2，氨基酸序列如SEQ ID NO:03所示的CDR-L3，氨基酸序列如SEQ ID NO:04所示的CDR-H1，氨基酸序列如SEQ ID NO:05所示的CDR-H2，氨基酸序列如SEQ ID NO:06所示的CDR-H3。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗體選自單克隆抗體、雙特異性抗體、特異性結(jié)合人PI3K的抗體片段、特異性結(jié)合人PI3K抗體片段的融合蛋白、嵌合抗體、人源化抗體和人源化單克隆抗體。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗體包含抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示或與SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的VH序列；所述抗體包含抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示或與SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的VL序列，所述抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述抗體輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述抗體包含選自人抗體IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述抗體的生產(chǎn)步驟包括：在培養(yǎng)基中和合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求3所述抗體的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)基中或從所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中回收產(chǎn)生的抗體及其抗體片段。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述抗體能夠用于促進(jìn)肝肝細(xì)胞體外增殖及三維表型的穩(wěn)固。