[發明專利]基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹瀉病毒的檢測方法有效

申請號：	202010905632.8	申請日：	2020-09-01
公開（公告）號：	CN111979357B	公開（公告）日：	2022-06-07
發明（設計）人：	倪偉;胡圣偉;姚瑞;李村院;李曉悅;徐越仁	申請（專利權）人：	石河子大學
主分類號：	C12Q1/70	分類號：	C12Q1/70;C12Q1/682;C12N15/11
代理公司：	烏魯木齊恒智專利商標代理事務所(普通合伙) 65102	代理人：	李靖
地址：	832000 新疆維吾爾***	國省代碼：	新疆;65
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摘要：
搜索關鍵詞：	基于 crispr cas13a 病毒性腹瀉病毒檢測方法
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【權利要求書】：

1.一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的引物，其特征在于：所述引物為：5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCAUCCAACGAACUCACCACUGUUGCU-3’。

2.一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于：

包含純化的LwCas13a蛋白45nM、特異性crRNA 22.5nM、淬滅熒光報告分子RNA 125nM、RNase抑制劑2uL和檢測緩沖液的總體積40uL；

所述特異性crRNA為權利要求1所述的引物；

所述淬滅熒光報告分子RNA為：5’-GAAGAAGAGUUUAUUCAGAUAGAUUUGU-3’，

5'端修飾為FAM，3'端修飾為BHQ-1。

3.如權利要求2所述的用于檢測牛病毒性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于：

純化的LwCas13a蛋白純化步驟如下：先構建LwCas13a原核表達載體，將LwCas13a編碼基因克隆至原核表達載體pET-28a⁺上構建pET-28a⁺-LwCas13a重組表達載體，之后將pET-28a⁺-LwCas13a重組表達載體轉入Rosetta^TM(DE3)擴大培養，低溫誘導其表達LwCas13a蛋白，在通過鎳柱親和層析法獲得純化的LwCas13a蛋白。

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