[發明專利]一種不添加沉降劑的臍血干細胞富集方法

有效

• 申請號: 202010903196.0
• 申請日: 2020-09-01
• 公開（公告）號: CN111961646B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 趙清剛;雒猛;劉慶凱;王洪寶
• 申請（專利權）人: 山東省齊魯干細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 劉紅陽

本發明公開了一種不添加沉降劑的臍血干細胞富集方法，包括以下步驟：(1)將臍帶血進行三次離心處理后，得到初次富集液；(2)將初次富集液進行冷藏處理30?40min；(3)制備通道高度為55?65μm二維叉指芯片，將冷藏處理后的初次富集液注入二維叉指芯片中，施加電壓為7?9V、電流為2.8?3.2MHz的交流信號，富集處理20?30秒后，得到臍血干細胞。本發明提供的一種不添加沉降劑的臍血干細胞富集方法，操作簡單，在富集的過程中不添加羥乙基淀粉，但是保證了富集的效率和質量，保證了臍血干細胞凍存后的質量。

技術領域

本發明屬于移植用臍帶血的干細胞富集方法技術領域，具體涉及一種不添加沉降劑的臍血干細胞富集方法。

背景技術

臍帶血的保存是在-196的液氮中長期保存，應用時進行復蘇，臍帶血采集后在釆血袋保存，一般容量在80-150mL之間，在臍帶血被凍存入液氮之前需要將臍帶血進行減容并富集干細胞。目前干細胞的富集方法為：

1)根據臍帶血的容量按照比例添加羥乙基淀粉(HES)；

2)按照一定離心轉速進行離心富集，方案為：第一次離心RCF＝50g,離心時間6分鐘，第二次離心RCF＝600g,離心5分鐘，第三次離心RCF＝600g,離心5分鐘。

現有的方案存在以下缺點：現有的方案需要添加HES，而HES使用后會對人體的健康存在著潛在的威脅，如在特定健康條件的患者(如嚴重膿毒血癥、肝腎功能障礙、凝血功能異常等)中存在著死亡率升高、腎損害及過量出血等風險。HES類產品已不再應用于危重成人患者，包括敗血癥、膿毒血癥、燒傷、收入ICU的患者。

發明內容

為了解決現有技術的缺陷，本發明提供一種不添加沉降劑的臍血干細胞富集方法。

本發明是通過以下技術方案實現的。

一種不添加沉降劑的臍血干細胞富集方法，包括以下步驟：

(1)將臍帶血進行三次離心處理后，得到初次富集液；

(2)將初次富集液進行冷藏處理30-40min；

(3)制備通道高度為55-65μm二維叉指芯片，將冷藏處理后的初次富集液注入二維叉指芯片中，施加電壓為7-9V、電流為2.8-3.2MHz的交流信號，富集處理20-30秒后，得到臍血干細胞。

具體地，上述步驟(1)中，三次離心處理的具體操作為：第一次離心時的離心力大小為500-600g，離心時間230-250秒，第二次離心時的離心力大小為1300-1500g，離心時間280-320秒，第三次離心時的離心力大小為1300-1500g，離心時間280-320秒，臍帶血第一次離心后，在本發明提供的離心力和離心時間下，臍血中的細胞會因為自身大小和密度的不同，沉降速度不同，從而形成分層，從上到下分別為血漿，有核細胞和血小板，紅細胞三層，此步相對離心力較低，因此有核細胞會在上層血漿分布較廣，有利于富集有核細胞；第二次離心，在此步離心中，在1300-1500g的相對離心力下，臍血也會分成三層，由于相對離心力較大，分層會比較清晰，有利于去除下層紅細胞和控制有核細胞的體積；第三次離心，在此離心力和離心時間下，臍血也會分成三層，由于相對離心力較大，分層會比較清晰，有利于此步將血漿去除；本發明采用的是三次離心，若離心次數過少不利于有核細胞的富集，有核細胞回收率會過低，若離心次數過多會造成溶血，對臍血干細胞造成損傷。

具體地，上述步驟(2)中，冷藏處理時的溫度為2-6℃。

具體地，上述步驟(3)中，二維叉指芯片在使用前，通道采用吐溫20溶液潤濕處理后，再采用去離子水進行清洗。

由以上的技術方案可知，本發明的有益效果是：