[發明專利]一種多能干細胞定向分化為功能性心肌的方法

在審

• 申請號: 202010891948.6
• 申請日: 2014-09-19
• 公開（公告）號: CN112175900A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: WH·齊默爾曼;J·哈德森;M·蒂布爾齊
• 申請（專利權）人: 修復股份有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/0735;C12N5/075;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 張偉

1.一種無血清生物工程化心肌(BHM)，其通過包括如下步驟的方法生產：

(i)在合適的模具中以(2.5-6×10⁶個細胞/1mg膠原蛋白)/1ml培養基的比率接種多能干細胞，然后在基礎培養基中培養，所述基礎培養基包含有效量的(a)BMP4、激活素A、FGF2、GSK3-抑制劑，和(b)得到終濃度為0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml轉鐵蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亞硒酸鈉、0.4-40μg/ml L-肉堿HCl、0.1-10μg/ml氫化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸補充劑、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)的無血清補充劑，由此誘導所述多能干細胞的中胚層分化；

(ii)在基礎培養基中培養步驟(i)中得到的細胞，所述基礎培養基包含有效量的Wnt-信號傳導通路抑制劑和如步驟(i)中的無血清補充劑，由此誘導所述細胞的心肌分化；和

(iii)在機械刺激下，在基礎培養基中培養步驟(ii)中得到的細胞，所述基礎培養基包含有效量的如步驟(i)中的無血清補充劑，由此促進心肌成熟。

2.根據權利要求1所述的BHM，其中步驟(iii)中的培養所述細胞在動態機械刺激或靜態拉伸下進行。

3.根據權利要求1或2所述的BHM，其中步驟(iii)的基礎培養基

a)進一步包含0.1-10ng/ml TGFβ1，優選地約1ng/ml TGFβ1；和/或

b)不包含有效量的FGF2；和/或

c)包含0.5-3mM Ca²⁺，最優選地約1.2mM Ca²⁺。

4.根據權利要求1-3中任一項所述的BHM，其中與成人的心臟組織相比，所述BHM具有低的但是仍然保留的祖基因的表達，特別是其中與成人的心臟組織相比，所述BHM具有低的但是仍然保留的ISL-1的表達。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的BHM，其中所述BHM包含心肌細胞和CD90⁺基質細胞，特別是其中所述BHM包含約50％心肌細胞，剩余主要為CD90⁺基質細胞。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的BHM，其中步驟(i)中的膠原蛋白選自I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、V型膠原蛋白及它們的混合物，優選地其中所述膠原蛋白包含至少90％的I型膠原蛋白；和/或

其中步驟(i)中的膠原蛋白是人來源的、牛來源的、豬來源的或海洋生物來源的，如藻類或魚來源的，或其中所述膠原蛋白是重組膠原蛋白。

7.根據權利要求6所述的BHM，其中所述膠原蛋白進一步包含一種或多種選自彈性蛋白、層粘連蛋白、副層粘蛋白、巢蛋白、蛋白聚糖和纖連蛋白的細胞外基質組分。

8.根據權利要求1-7中任一項所述的BHM，其中所述BHM

(a)能夠在直到至少3Hz的多個頻率下起博；和/或

(b)響應增加的靜息長度和靜息張力呈現增加的顫搐張力；和/或

(c)呈現大于0.2mM的鈣EC₅₀；和/或

(d)呈現大于200μN的顫搐張力；和/或

(e)在0.6mM鈣的起博條件下，對1μM的異丙腎上腺素呈現大于40μN的變力響應；和/或

(f)能夠維持至少62天。

9.根據權利要求1-8中任一項所述的BHM，其中所述多能干細胞選自胚胎干細胞、誘導多能干細胞和孤雌生殖干細胞；和/或其中所述多能干細胞為靈長類動物來源的多能干細胞。

10.根據權利要求9所述的BHM，其中所述多能干細胞為人多能干細胞。