[發(fā)明專利]一種樟樹芳樟醇合成酶、以及鑒定芳樟醇型樟樹的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010891874.6
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111808838B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪信東;張月婷;符潮;邱鳳英;楊海寬;戴小英;章挺;何小三;李江
• 申請（專利權(quán)）人: 江西省林業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 南昌邁恩知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 36139
• 代理人: 徐克寒

本發(fā)明涉及樟樹芳樟醇合成酶，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。還提供了一種用于鑒定芳樟型樟樹的分子標(biāo)記，以樟樹為檢測材料、提取待檢測樟樹基因組DNA；利用WZF01特異性引物以樟樹基因組DNA為模板進行PCR擴增，當(dāng)含有約1200bp擴增目的條帶時，判斷其為芳樟醇型樟樹。本發(fā)明提供的WZF01特異性引物追蹤芳樟醇型樟樹準(zhǔn)確率99％以上，準(zhǔn)確性高，操作簡單，成本低廉的特點且適合苗期鑒定，大大提高了芳樟型樟樹的選育效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及樟樹化學(xué)型快速鑒定的方法，具體涉及一種樟樹芳樟醇合成酶、以及鑒定芳樟醇型樟樹的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

樟樹(Cinnamomum camphora)為樟科樟屬常綠喬木樹種，為我國Ⅱ級保護植物，是一種集材用、藥用、香精香料、油用、園林觀賞和生態(tài)文化等于一體的多用途樹種，具有較大的開發(fā)利用潛力。根據(jù)樟樹葉精油中所含主成分的不同，可將樟樹分為不同的化學(xué)型，常見為樟腦型(主成分為樟腦)、芳樟醇型(主成分為芳樟醇)、桉葉油素型(主成分為1,8-桉葉油素)、橙花叔醇型(主成分為異橙花叔醇)和龍腦型(主成分為右旋龍腦)等5種化學(xué)型。1968年，Rolf Santesson博士和他的兒子Johan首次提出植物“化學(xué)型(chemotype)”概念，將之定義為“群體中個體間不能通過形態(tài)學(xué)區(qū)分的化學(xué)特性。不同化學(xué)類型樟樹表型并無明顯區(qū)別、不能通過常規(guī)的分類學(xué)特征進行區(qū)分。樟樹是我國主要的天然木本精油植物資源之一，具有很高的開發(fā)利用價值。不同化學(xué)型樟樹用途迥異，如從芳樟醇型樟樹提取的芳樟醇位居世界香料市場上用途最廣的20大成分前列，而從龍腦樟中提取的天然龍腦則為我國傳統(tǒng)珍稀中藥材。樟樹自然群體中，調(diào)查發(fā)現(xiàn)芳樟醇型樟樹比例低于5.00％，如何快速鑒別出芳樟醇型樟樹是樟樹精油工業(yè)原料林建設(shè)中遇到首要問題。傳統(tǒng)生產(chǎn)上，不同化學(xué)類型樟樹個體篩選主要依賴于科技人員經(jīng)驗性的“聞香法”，盡管該法操作簡單，但準(zhǔn)確率因人而異且無科學(xué)量化依據(jù)。實驗室中，鑒別不同化學(xué)型樟樹則通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)開展，結(jié)果可靠但程序繁蕪且成本較高。另一方面，芳樟醇型樟樹后代種子實生苗會產(chǎn)生大量變異、形成不同化學(xué)型后代個體，初生1-2年內(nèi)種苗精油成分一直處于快速波動中、經(jīng)驗性的“聞香法”很難用于芳樟醇型后代個體的早期篩選，實生苗不能應(yīng)用于大規(guī)模良種繁育中，造成了良種更新緩慢，優(yōu)良基因資源大量流失。

芳樟醇屬于單萜類化合物，是植物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的成千上萬種天然萜類化合物之一。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明，植物合成天然萜類化合物種類主要由體內(nèi)萜類合成酶(Terpene synthases,TPS)基因控制。目前，在其它植物中，如黃花蒿(Artemisia annua)、檸檬留蘭香(Mentha citrata)、檸檬香桃(Lemon Myrtle)、羅勒(Ocimum basilicum)、仙女扇(Clarkia breweri)及薰衣草(Lavandula angustifolia)等，控制芳樟醇合成的TPS已被分離克隆，命名為芳樟醇合成酶。植物主要通過TPS基因差異化表達而調(diào)控某種萜類化合物含量進而形成特定的化學(xué)型。TPS基因是鑒別植物個體化學(xué)型的關(guān)鍵靶標(biāo)基因之一。迄今，控制樟樹芳樟醇合成的關(guān)鍵TPS基因之前還未被公開報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，分離出一種芳樟醇合成酶，基于該合成酶的編碼框(ORF)與其啟動子區(qū)核苷酸序列開發(fā)特異引物，可以快速、準(zhǔn)確的鑒定出芳樟醇型樟樹。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種樟樹芳樟醇合成酶，所述芳樟醇合成酶(TPS12)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

進一步地，所述樟樹芳樟醇合成酶基因的開放閱讀框序列為如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種用于鑒定芳樟型樟樹的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記(WZF01)引物信息為：

WZF01-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；