[發(fā)明專利]基于視網(wǎng)膜組織/類器官-視網(wǎng)膜組織制備單細(xì)胞懸液的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010890745.5
• 申請日: 2020-08-29
• 公開（公告）號: CN111925988B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭廣華;王少軍
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 河南科技通律師事務(wù)所 41123
• 代理人: 張建東

本發(fā)明涉及一種基于視網(wǎng)膜組織/類器官?視網(wǎng)膜組織制備單細(xì)胞懸液的方法。本發(fā)明選用視網(wǎng)膜組織或類器官?視網(wǎng)膜組織，并篩選出高效兩種消化酶及其使用劑量和濃度、使用比例和酶的作用時(shí)間等，確保視網(wǎng)膜單細(xì)胞懸液內(nèi)各類細(xì)胞的高活性率（存活率≥90%以上，符合細(xì)胞建庫要求）、低結(jié)團(tuán)率和低死細(xì)胞率；本發(fā)明方法操作簡便、耗時(shí)短，可為視網(wǎng)膜單細(xì)胞RNA?Sequence測序和ATCT?Sequence測序等提供高效的活細(xì)胞；進(jìn)而對測序獲得的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和挖掘，揭示視網(wǎng)膜發(fā)育過程中不同細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)錄因子變化規(guī)律，揭示細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變過程中各類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化規(guī)律。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及眼科試驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于視網(wǎng)膜組織/類器官-視網(wǎng)膜組織制備單細(xì)胞懸液的方法。

背景技術(shù)

世界衛(wèi)生組織三個(gè)大樣本的流行病學(xué)調(diào)查顯示，致盲性眼病已成為繼腫瘤、 心血管疾病之后的第三位影響人們生存質(zhì)量的疾病。由于遺傳缺陷、衰老或代謝等因素，導(dǎo)致以視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性為特征的視網(wǎng)膜變性疾病，是造成不可逆性失明的最主要原因。視網(wǎng)膜變性疾病是一類嚴(yán)重的致盲性疾病,最主要分為視網(wǎng)膜色素變性 (retinitispigmentosa, RP)和年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration, AMD)。遺傳性RP多發(fā)于少年和青壯年，患者在青壯年時(shí)期雙眼失明，國內(nèi)發(fā)病率為0.3%；AMD常見于中老年人，且隨年齡增加，發(fā)病率逐年升高，成為老年致盲的主要疾病。我國每年因視網(wǎng)膜遺傳缺陷、衰老或代謝疾病導(dǎo)致以視網(wǎng)膜 感光細(xì)胞變性為特征的視網(wǎng)膜變性疾病，引起失明的患者高達(dá)200萬，不僅嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，而且增加社會(huì)負(fù)擔(dān)，開展視網(wǎng)膜變性致盲性眼病研究是我國經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的重大需求。目前，視網(wǎng)膜疾病的基礎(chǔ)與臨床研究是國際科技前沿的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

視網(wǎng)膜組織含有復(fù)雜的十類細(xì)胞類型，各類細(xì)胞之間相互連接，相互依存，組織結(jié)構(gòu)精細(xì)；尤其是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)育、成熟過程漫長，需要經(jīng)歷視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖、視網(wǎng)膜感光祖細(xì)胞譜系發(fā)育、視網(wǎng)膜感光細(xì)胞亞型形成、突觸連接和感光細(xì)胞外節(jié)生長等一系列階段。目前已發(fā)現(xiàn)七種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這些因子包括OTX2、CRX、NRL、NR2E3、PIAS3、RORβ 和TRβ2。視網(wǎng)膜感光祖細(xì)胞向視錐或視桿細(xì)胞分化的命運(yùn)，取決于在特定時(shí)期這些轉(zhuǎn)錄因子的活躍或者沉默。這些轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同及精準(zhǔn)控制，在視網(wǎng)膜感光祖細(xì)胞向視網(wǎng)膜感光細(xì)胞亞型視錐和視桿細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。但是目前對于上述這些因子動(dòng)態(tài)變化的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。常規(guī)的基于群體的轉(zhuǎn)錄組分析方法無法揭示單個(gè)細(xì)胞之間基因表達(dá)的異質(zhì)性，也難以對極少量稀有細(xì)胞進(jìn)行分析，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)為此供了有效的研究工具。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序是作為推動(dòng)干細(xì)胞生物學(xué)研究強(qiáng)大技術(shù)手段之一，它能呈現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，對測序獲得的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和挖掘，從而揭示發(fā)育過程中不同細(xì)胞群體的轉(zhuǎn)錄因子變化規(guī)律，尤其適合揭示細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變過程中各類細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化規(guī)律。制備視網(wǎng)膜組織單細(xì)胞懸液，并使其符合細(xì)胞建庫標(biāo)準(zhǔn)，對于闡述視網(wǎng)膜發(fā)育和視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

目前，國內(nèi)外視覺科學(xué)研究領(lǐng)域中，體外獲得視網(wǎng)膜的常用方法是用酶消化和顯微解剖分離方法。然而，現(xiàn)有的這兩種方法均耗時(shí)較長，一般需要 15-25 分鐘。而實(shí)踐證明，當(dāng)視網(wǎng)膜離開活體 15-25分鐘后，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的死亡率可達(dá) 40-60%；這顯然對后續(xù)進(jìn)行的視網(wǎng)膜基礎(chǔ)與臨床研究能否成功將產(chǎn)生較大影響，極有可能因?yàn)橐暰W(wǎng)膜離體時(shí)間過長，造成研究結(jié)果失真的嚴(yán)重后果。

因此，急需改進(jìn)現(xiàn)有的視網(wǎng)膜取出技術(shù)，以便能快速、高效地取出視網(wǎng)膜，提高視網(wǎng)膜各類細(xì)胞的存活率，以便獲得真實(shí)的研究結(jié)果，為防盲致盲的基礎(chǔ)與臨床研究提供技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種視網(wǎng)膜組織/類器官-視網(wǎng)膜制備單細(xì)胞懸液的方法，以期能夠解決現(xiàn)有技術(shù)耗時(shí)長、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的死亡率高的問題。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

設(shè)計(jì)一種基于視網(wǎng)膜組織制備單細(xì)胞懸液的方法，包括如下步驟：