[發明專利]一套等位基因高效替換系統及其建立方法

在審

• 申請號: 202010889546.2
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111944847A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 張智英;李鵬程;李欣憶;唐寶瑩;魏澤輝
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90
• 代理公司: 成都坤倫厚樸專利代理事務所(普通合伙) 51247
• 代理人: 吳亦雨

1.一種雙篩選表達盒，其特征在于：針對位于兩條姐妹染色單體的等位基因，分別引入了兩種不同的熒光蛋白、兩種不同的抗性基因，并分別添加胸腺激酶負向篩選基因。

2.根據權利要求1所述的雙篩選表達盒，其特征在于：所述雙篩選表達盒由CAG啟動子啟動轉錄翻譯。

3.根據權利要求1所述的雙篩選表達盒，其特征在于：所述雙篩選表達盒的剪切肽序列為T₂A和/或P₂A。

4.根據權利要求1所述的雙篩選表達盒，其特征在于：所述雙篩選表達盒的表達盒終止信號為BGH polyA。

5.一種等位基因替換系統，包括權利要求1～4任意一項所述的雙篩選表達盒。

6.根據權利要求5所述的等位基因替換系統，其特征在于：還包括一對對應基因組靶點的CRISPR/Cas9-sgRNA表達載體，分別對應待替換基因的起始和終止密碼子，可將待替換基因完整敲出。

7.根據權利要求6所述的等位基因替換系統，其特征在于：所述CRISPR/Cas9-sgRNA表達載體的結構為：px330-U6-sgATG-CBh-hSpCas9和px330-U6-sgTGA-CBh-hSpCas9。

8.一種利用權利要求1～4任意一項所述的雙篩選表達盒或利用權利要求5～7任意一項所述的等位基因替換系統進行等位基因替換的方法，其特征在于：基于真核生物體基因組DNA雙鏈斷裂修復機制，在CRISPR/Cas9介導的基因組靶向切割引發細胞內源同源重組修復過程中，向等位基因位點引入待替換基因和所述雙篩選表達盒。

9.根據權利要求8所述的等位基因替換的方法，其特征在于：按真核生物體基因組DNA雙鏈斷裂修復機制設計兩步法進行打靶，

(1)通過HDR將篩選基因和編輯序列整合至基因組中；

(2)在雙篩選表達盒兩側制造雙鏈斷裂，利用雙篩選表達盒5’和3’序列外側的同向同源DNA序列，通過單鏈退火修復機制，實現基因組序列的嚴格修復。