[發明專利]一種甜橙抗寒基因CsLAC18及其應用

有效

• 申請號: 202010885928.8
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111961680B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 徐小勇;張越良;張亦武;周一鵬;孔維文
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/11;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 杜春秋

本發明提出了一種從甜橙中分離、克隆得到的抗寒功能基因CsLac18，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其對應的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。將本發明的基因CsLac18導入到煙草及枳殼中進行功能驗證，發現獲得的轉基因超表達植物抗寒能力明顯提高，而轉基因沉默表達植物抗寒能力明顯降低。本發明為植物抗寒基因工程提供重要的基因資源，能夠提高植物的抗寒性能。

技術領域

本發明涉及一種從甜橙（Citrus sinensis）中分離、克隆得到的一個低溫誘導漆酶基因CsLAC18，該基因具有抗寒功能，還涉及一種甜橙抗寒轉運蛋白基因CsLAC18在植物抗寒改良中的應用，即將上述基因轉化到煙草及枳，獲得的轉基因超表達植物抗寒能力明顯提高，而轉基因沉默表達植物抗寒能力明顯降低，屬于植物基因工程技術領域。

背景技術

柑橘作為我國乃至全球范圍內第一大類水果，也是在我國南部地區栽培面積最廣、產品產量最大、經濟地位最高的果樹類園藝作物。我國柑橘產業迅速發展，栽培面積從1978年的17.8萬hm²發展到2017年的268.88萬hm²，增長了約15倍，總產量從1978年的38.3萬噸發展到2017年的3853.32萬噸，增長了近100倍。柑橘產業的蓬勃發展不僅豐富了果品市場，還在農業經濟振興和供給側改革方面發揮著不可忽視的作用。柑橘類果樹的地域主要分布在北緯35°以南的區域，特點是喜溫暖和濕潤氣候條件，而我國的經濟商用的栽培柑橘主要分布在北緯20～33°之間的亞熱帶地區，種植區主要在于長江沿線以南和秦嶺以南，受分布地域影響，越冬凍害時有發生；有學者提出柑橘越冬期凍害不僅與冬季降溫強度有關，還與冬季干旱、降溫過程伴隨雨雪等有關，因此，自然條件在很大程度上制約了柑橘產業的發展，它輕則影響植株生長，損傷樹體，導致結果樹減產，影響果實品質，重則造成樹體死亡，果園毀滅。因此，研究柑橘抗寒性對于其抗寒育種和北移栽培都具有重要意義。由于絕大多數的柑橘類果樹為多胚類型，其無性胚發育優于有性胚，造成后者發育不良，加之柑橘童期長、遺傳高度雜合等限制因素，采用有性雜交或者常規育種方法很難有效的獲得柑橘抗寒品種。然而，迅猛發展的生物技術為植物育種提供了新的途徑，通過基因工程可以對作物進行定向的遺傳改良，已經在培育作物抗逆新品種（材料）中展現出重要的利用價值。而，發掘和鑒定抗逆基因是利用基因工程創制抗逆轉基因植株的前提和關鍵。

低溫對植物的傷害分為兩種，一種是零上低溫（0～12℃）造成的，稱之為寒害（chilling stress），另一種是零下低溫造成的，稱之為凍害（freezing stress）。凍害容易導致干旱脅迫綜合癥，使植物細胞結冰形成冰晶，并且使細胞嚴重脫水，機械性傷害并最終導致植物死亡，對植物造成直接的物理傷害；而寒害則是一個間接緩慢的過程，會抑制生長速度和葉片膨脹，破壞細胞結構，影響其關鍵的生理功能。低溫脅迫引起滲透脅迫，這會導致膨壓喪失，破壞膜的穩定性、使蛋白質失活或變性、積累活性氧（Reactive OxygenSpecies, ROS）產生氧化損傷，進而導致光合作用被抑制、代謝功能紊亂和細胞結構遭到破壞。最終影響植物的生長發育，嚴重時會導致植株完全死亡。

低溫脅迫可能對植物產生諸多不利影響，包括抑制種子發芽，減少植物生長和繁殖以及降低作物產量和品質。首先，低溫會改變細胞膜的流動性，這可能會影響膜定位蛋白的功能以觸發下游反應；第二，極端溫度會嚴重影響酶的活性。例如活性氧（ROS）清除酶可能會受到影響，從而導致氧化應激；第三，低溫會對細胞生理產生相當大的影響，例如蛋白質復合物和RNA二級結構的失穩，最終導致光抑制和代謝失衡。此外低溫是影響作物產量以及限制植物地理分布的重要因子之一。

通過傳統育種方法得到柑橘抗性增強的品種是一個耗時耗力且十分困難的工程。隨著現代基因工程的迅速發展，依托新型生物技術方法已成為培育柑橘抗性種質資源的重要途徑。