[發明專利]一種合成D-阿洛酮糖的基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010885629.4
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN112080453B
• 公開（公告）日: 2022-12-23
• 發明（設計）人: 秦慧民;路福平;毛淑紅;李超
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P19/24;C12P19/02;C12R1/125
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

一種合成D?阿洛酮糖的基因工程菌及其構建方法與應用。本發明提供一種能夠利用D?果糖合成D?阿洛酮糖的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構建方法，具體是以枯草芽孢桿菌WB600為宿主菌，敲除了其基因組上的果糖激酶基因及PTS系統果糖特異性轉運蛋白元件IIABC、IID的基因，得到枯草芽孢桿菌突變體，并進一步在宿主菌中游離表達來源于球形節桿菌(Arthrobacter globiformis M30)的D?阿洛酮糖?3?差向異構酶編碼基因，獲得重組枯草芽孢桿菌。本發明的基因工程菌實現了底物D?果糖的充分利用，大大提高了生物合成D?阿洛酮糖的產量，有利于D?阿洛酮糖的工業化生產，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種合成D-阿洛酮糖的基因工程菌及其構建方法與應用，屬于生物技術和基因工程技術領域。

背景技術

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成員，是一種新型的低能量的甜味劑。因具有較高的甜度和較低的能量，D-阿洛酮糖被認為是一種理想的甜味劑和蔗糖的有效替代品。可幫助制造商減少配方中的蔗糖，用于開發低熱量食品飲料。同時，D-阿洛酮糖可以發生美拉德反應，有助于提升食品品質，可以完美替代糖的功能。此外，D-阿洛酮糖還具有獨特的生理功能，在臨床醫學領域具有潛在較大的應用價值。例如治療肥胖癥、糖尿病、高血壓、高血脂和動脈粥樣硬化等疾病，D-阿洛酮糖還可以通過添加輔料進行噴霧干燥，進而有助于肺部藥物給送。2011年美國FDA批準D-阿洛酮糖為GRAS物質，2019年，FDA又宣布將低熱量甜味劑D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“總糖”標簽之外，因此不需要在這兩項類目中計算其添加量，無疑將幫助其在未來進一步擴張市場。

D-阿洛酮糖的制備方法主要有化學合成法和生物轉化法，化學合成法主要是通過一些催化加氫、加成反應、Ferrier重排等反應來合成，但是這些化學合成方法存在反應步驟多、反應條件苛刻、產率較低、副產物多和分離純化困難等缺點。利用生物合成法生產D-阿洛酮糖，是利用微生物所產特異性的酶，專一性的催化底物合成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖-3-差向異構酶(D-allulose-3-epimerase，DAE)可以催化多種酮糖C3位的差向異構，是生產稀有糖的良好催化劑，以D-果糖為底物生產附加產值高的D-阿洛酮糖。目前為止，已經篩選并鑒定了至少18種酮糖3-差向異構酶，它們對D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-果糖、L-核酮糖具有較高的底物特異性。

pKSV7溫敏質粒無痕敲除技術是基于溫敏型質粒而不是線性DNA的方法用于快速敲除枯草芽孢桿菌染色體上的目的基因。pKSV7該質粒的基因組中含有：1)僅一種正篩選標記的抗性基因，該抗性基因的啟動子為雙功能啟動子；2)能在大腸桿菌中復制的復制子；3)能在芽胞桿菌中復制的溫敏型復制子。該技術的原理是以出發菌枯草芽孢桿菌WB600基因組為模板擴增得到待敲除基因的上下游同源臂，將上下游同源臂連接后，通過酶切位點的方式連接到pKSV7溫敏質粒上構建同源重組載體；然后將重組載體導入WB600中，通過篩選得到帶有抗性標記的重組菌，改變培養溫度，篩選無抗性標記的重組菌。得到目的基因缺失的重組菌，并在DNA水平進行鑒定。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為枯草桿菌的一個屬，是非致病菌且不含內毒素以及致熱致敏蛋白，被FDA和中國農業農村部等部門批準為食品級安全菌株。枯草芽孢桿菌發酵技術歷史悠久且研究充分，其表達系統沒有明顯密碼子偏好性，具有很強的蛋白分泌功能，細胞壁組成簡單，嚴格好氧性生長，培養條件簡單且生長迅速，遺傳背景研究比較清楚，并且具有良好的發酵基礎。

專利申請(CN 108251468 A)公開了一種生物法生產D-阿洛酮糖的工藝，包括由D-果糖制備生產D-阿洛酮糖的方法、由D-葡萄糖生產D-阿洛酮糖的工藝和由蔗糖生產D-阿洛酮糖的工藝。該生物法生產D-阿洛酮糖的工藝旨在重組細胞中表達3-差向異構酶；通過使用所表達的3-差向異構酶由D-果糖制備D-阿洛酮糖。本發明的生物法生產D-阿洛酮糖的工藝選用的3-差向異構酶具有活性高、耐高溫、穩定性好的優點，根據該發明的生產D-阿洛酮糖的工藝可由D-果糖或廉價的原料如蔗糖或D-葡萄糖大規模且連續地制備D-阿洛酮糖。