[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于檢測(cè)N-DMV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010884334.5
• 申請(qǐng)日: 2020-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111850177A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬(wàn)春和;黃瑜;程龍飛;傅光華;施少華;陳紅梅;傅秋玲;劉榮昌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)N?DMV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，引物序列如SEQ ID NO.1?2所示，具有很高的特異性和靈敏度。建立的方法能夠?qū)喨褐蠳?DMV感染進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化操作程序、節(jié)約成本。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)觀察其擴(kuò)增曲線結(jié)合Tm值即可直接對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。本發(fā)明的建立可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)N-DMV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，屬于獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

微核糖核酸科（Picornaviridae）病毒是一類(lèi)呈球形、無(wú)囊膜的單股正鏈病毒，其病毒顆粒直徑約20-30nm。前期基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)微核糖核酸科病毒長(zhǎng)度一般為6.6kb-9.8kb。典型的微核糖核酸科病毒的基因組一般僅含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（open readingframe，ORF），其兩側(cè)分別是5’-UTR和3’-UTR。目前，已見(jiàn)有火雞源、雞源、鴿源和鴨源微核糖核酸科Megrivirus屬（中文名暫未確定）成員被發(fā)現(xiàn)。對(duì)新型鴨源Megri病毒（novel duckmegrivirus, N-DMV）（Liao Q，等. Genomic characterization of a novelpicornavirus in Pekin ducks. 2014，172(1-2):78-91. doi: 10.1016/j.vetmic.2014.05.002.）基因組分析發(fā)現(xiàn)N-DMV具有類(lèi)似于Megrivirus屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)，其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序，但亦有自身的特點(diǎn)。不計(jì)poly(A)尾，N-DMV基因組長(zhǎng)度為9700bp，是微病毒科中最長(zhǎng)的。最顯著的特點(diǎn)位于2A區(qū)，該區(qū)由兩個(gè)功能未知的蛋白（2A1、2A2）和以及一個(gè)parachovirus樣2A3組成。研究還發(fā)現(xiàn)，N-DMV具有和火雞源、雞源、鴿源Megri病毒相似的基因組結(jié)構(gòu)特征，且在遺傳進(jìn)化上處于同一遺傳進(jìn)化分支。目前，由于N-DMV無(wú)法分離培養(yǎng)，關(guān)于N-DMV致病力、致病機(jī)理等相關(guān)研究還未見(jiàn)涉及。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法（Real time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系。但是，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)基于熒光染料TB Green對(duì)新型鴨源Megri病毒（N-DMV）進(jìn)行檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的引物研究報(bào)道，本發(fā)明的建立可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域研究空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)N-DMV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，具有很高的特異性和靈敏度。建立的方法能夠?qū)喨褐蠳-DMV感染進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化操作程序、節(jié)約成本。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案：

一種用于檢測(cè)N-DMV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，所述引物如下：

上游引物N-DMV-TBF1：5’- ATTGTGCCTCTCATTGTG -3’，

下游引物N-DMV-TBR1：5’- CAGTTCATAGCCATCTTCA -3’，

目的片段大小為107 bp。

包含所述引物的N-DMV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。

建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，反應(yīng)體系（20 μL）為：TB Green Mix混合液10.0 μL、上/下游引物（N-DMV-TBF1和N-DMV-TBR1）（10 μmol/L）各0.3 μL、模板1 μL、用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃ 1 min預(yù)變性；95℃ 10s、55℃ 30s、72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，做出溶解曲線。