[發明專利]N-DMV和N-DHCLV雙重實時熒光定量PCR鑒別檢測引物及試劑盒

有效

• 申請號: 202010883764.5
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN111961758B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 萬春和;黃瑜;程龍飛;傅光華;施少華;陳紅梅;傅秋玲;劉榮昌
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明提供N?DMV和N?DHCLV雙重實時熒光定量PCR鑒別檢測引物及試劑盒，引物序列如SEQ ID NO.1?4所示，具有很高的特異性和靈敏度。建立的方法能夠同時對鴨群中N?DMV和N?DHCLV流行病學情況及感染程度進行檢測，簡化操作程序、節約成本。實時熒光定量PCR反應結束后，通過觀察擴增曲線和Tm值即可直接對結果進行判斷。本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

技術領域

本發明提供新型鴨源Megri病毒（N-DMV）和新型鴨源類丙肝樣病毒（N-DHCLV）雙重實時熒光定量PCR檢測引物及試劑盒，屬于動物傳染病學領域。

背景技術

實時熒光定量PCR方法（Real time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參（或者外參法）對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系。實時熒光定量PCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。實時熒光定量PCR技術在檢測病原時不僅可以定性檢測病原的有無，而且還可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸檢測技術上被廣泛使用。雙重實時熒光定量PCR是一種特殊的熒光定量PCR形式，其突出的特點是一次實時熒光定量PCR反應可同時檢測兩種病原，對病原復雜或存在多種基因型的病原鑒別檢測十分有效。

微核糖核酸科（Picornaviridae）病毒是一類呈球形、無囊膜的單股正鏈病毒，其病毒顆粒直徑約20-30nm。前期基因組學研究發現微核糖核酸科病毒長度一般為6.6kb-9.8kb。典型的微核糖核酸科病毒的基因組一般僅含有一個大的開放閱讀框（open readingframe，ORF），其兩側分別是5’-UTR和3’-UTR。目前，已見有火雞源、雞源、鴿源和鴨源微核糖核酸科Megrivirus屬（中文名暫未確定）成員被發現。對新型鴨源Megri病毒（novel duckmegrivirus, N-DMV）新型鴨源Megri病毒（novel duck megrivirus, N-DMV）（Liao Q，等.Genomic characterization of a novel picornavirus in Pekin ducks. 2014，172(1-2):78-91. doi: 10.1016/j.vetmic.2014.05.002.）基因組分析發現N-DMV具有類似于Megrivirus屬病毒的基因組結構，其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序，但亦有自身的特點。不計poly(A)尾，N-DMV基因組長度為9700bp，是微病毒科中最長的。最顯著的特點位于2A區，該區由兩個功能未知的蛋白（2A1、2A2）和以及一個parachovirus樣2A3組成。研究還發現，N-DMV具有和火雞源、雞源、鴿源Megri病毒相似的基因組結構特征，且在遺傳進化上處于同一遺傳進化分支。