[發(fā)明專利]一種N-DHCLV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010883750.3
• 申請(qǐng)日: 2020-08-28
• 公開（公告）號(hào): CN111826471A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬(wàn)春和;黃瑜;程龍飛;傅光華;施少華;陳紅梅;傅秋玲;劉榮昌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

本發(fā)明涉及一種N?DHCLV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及試劑盒，屬于動(dòng)物傳染病學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明包括特異性引物和探針序列的設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增方法的建立和優(yōu)化及結(jié)果檢測(cè)判定。本發(fā)明利用所述引物和探針建立的檢測(cè)N?DHCLV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，在檢測(cè)N?DHCLV上靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，最低可檢測(cè)55.93個(gè)拷貝，可用于檢測(cè)臨床樣本中N?DHCLV的感染檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種N-DHCLV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及試劑盒，屬于動(dòng)物傳染病學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系。熒光探針?lè)ㄊ怯眯蛄刑禺惖臒晒鈽?biāo)記探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物，探針?lè)ǖ某霈F(xiàn)使得定量PCR技術(shù)的特異性比常規(guī)PCR技術(shù)大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交探針(熒光共振能量傳遞探針)和分子信標(biāo)（molecular Beacon）。TaqMan探針?lè)ㄊ侵窹CR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)，如Eclipse、TAMRA、BHQ1等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5′端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團(tuán)淬滅，儀器檢測(cè)不到5′端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào)(就是說(shuō)5’熒光基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)正好是3’ 熒光基團(tuán)的吸收波長(zhǎng)，因而能量被吸收傳遞到3’熒光基團(tuán)而發(fā)出其它熒光)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會(huì)切割探針，釋放5′端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，5′端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)就可以被探頭檢測(cè)到。也就是說(shuō)每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，報(bào)告信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

黃病毒科（Flaviviridae Family）是一個(gè)基因組為單股正鏈 RNA 的小包膜病毒科，其中大多數(shù)病毒感染哺乳動(dòng)物和鳥類，且許多病毒具有宿主特異性和致病性。基于RdRP 保守區(qū)域氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，黃病毒科成員聚集在當(dāng)前指定的4個(gè)病毒屬中，包括黃病毒屬（Flavivirus genus）、瘟病毒屬（Pestivirus genus）、丙型肝炎病毒屬（Hepacivirus genus）、佩吉病毒屬（Pegivirus genus）。其中，塔瑪納蝙蝠病毒（Tamana bat virus）分配于一獨(dú)立的分支，暫被列為黃病毒屬（Flavivirus）的一個(gè)潛在成員。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序和血清學(xué)方法的廣泛應(yīng)用，不少研究者在不同哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了多種新型HCV同源病毒（HCV樣病毒）。新型鴨源類丙肝樣病毒（novel duck hepacivirus-like，N-DHCLV）（Chu L，等. A highly divergent hepacivirus-like flavivirus in domesticducks. J Gen Virol. 2019, 100(8):1234-1240. doi: 10.1099/jgv.0.001298.）是近年來(lái)從產(chǎn)蛋遺傳鴨群中發(fā)現(xiàn)的新發(fā)現(xiàn)HCV同源病毒（HCV樣病毒）。基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其基因組為單股正鏈RNA，基因組長(zhǎng)為11422bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為10824bp的開放閱讀框（openreading frame，ORF），編碼的多聚蛋白長(zhǎng)為3607個(gè)氨基酸。遺傳進(jìn)化分析表明，其屬于類丙肝樣病毒屬成員。