[發明專利]一種抗ASFV-p30蛋白的納米抗體及其制備方法和應用在審
| 申請號： | 202010883659.1 | 申請日： | 2020-08-28 |
| 公開（公告）號： | CN111944044A | 公開（公告）日： | 2020-11-17 |
| 發明（設計）人： | 趙欽;趙加凱;孫亞妮;周恩民 | 申請（專利權）人： | 西北農林科技大學 |
| 主分類號： | C07K16/08 | 分類號： | C07K16/08;C12N15/13;C07K19/00;C12N9/08;G01N33/68;G01N33/58;G01N33/569;G01N33/543 |
| 代理公司： | 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562 | 代理人： | 張換君 |
| 地址： | 712100 *** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 asfv p30 蛋白 納米 抗體 及其 制備 方法 應用 | ||
1.一種抗ASFV-p30蛋白的納米抗體，其特征在于：命名為ASFV-p30-Nb12，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一種抗ASFV-p30蛋白的納米抗體，其特征在于：命名為ASFV-p30-Nb37，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根據權利要求1-2任一項所述的納米抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將ASFV-p30蛋白與佐劑乳化后，注射雙峰駝動物，連續注射五次，每次間隔2周；
(2)最后一次注射免疫7天后，采集外周血分離淋巴細胞，構建抗ASFV-p30蛋白的噬菌體展示文庫；
(3)利用噬菌體展示技術，淘汰掉不結合的噬菌體，篩選并測序獲得了特異性結合噬菌體的兩種不同的納米抗體。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述佐劑具體為：第一次用完全弗氏佐劑，后四次用不完全弗氏佐劑。
5.一種編碼權利要求1所述納米抗體氨基酸序列的核苷酸分子，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
6.一種編碼權利要求2所述納米抗體氨基酸序列的核苷酸分子，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
7.一種含有權利要求1-2任一項所述的納米抗體與辣根過氧化物酶的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由納米抗體ASFV-p30-Nb12或ASFV-p30-Nb37與HRP串聯而成。
8.根據權利要求7所述的納米抗體與HRP的融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)重組真核表達載體的構建：通過雙酶切，將所述編碼納米抗體ASFV-p30-Nb12或ASFV-p30-Nb37的基因序列連接至pEGFP-N1-HRP載體中獲得陽性質粒；
(2)將步驟(1)中陽性質粒轉化宿主細胞，誘導表達納米抗體與HRP融合蛋白。
9.根據權利要求7所述的融合蛋白在制備檢測豬血清中抗ASFV抗體的產品中的應用。
10.根據權利要求9所述的融合蛋白在制備檢測豬血清中抗ASFV抗體的產品中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
(1)ELISA板上包被ASFV-p30蛋白，得到已包被了ASFV-p30蛋白的ELISA板；
(2)將納米抗體與HRP融合蛋白與豬血清混合，得到混合物；
(3)將步驟(2)所述混合物加至步驟(1)中已包被了ASFV-p30蛋白的ELISA板上孵育，孵育后加入顯色液避光反應；
(4)在步驟(3)中加入3M濃硫酸終止反應；
(5)顏色觀察：豬血清中有抗ASFV-P30抗體，酶標板沒有顏色變化，即為無色；若血清中沒有抗ASFV-P30抗體，酶標板則變為黃色。
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