[發明專利]基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法

在審

• 申請號: 202010883055.7
• 申請日: 2020-08-28
• 公開（公告）號: CN114107454A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 莫茜;陶悅;杜白露
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/70;C12Q1/04
• 代理公司: 上海十蕙一蘭知識產權代理有限公司 31331
• 代理人: 劉秋蘭

1.一種基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法，其特征在于所述呼吸道感染性疾病病原檢測方法基于宏基因組/宏轉錄組測序進行檢測，具體包括如下步驟：

步驟S1：將采集到的一份呼吸道待測樣本進行破壁處理，然后用DNA提取試劑盒提取DNA；將采集的另一份呼吸道待測樣本直接用RNA提取試劑盒提取RNA；

步驟S2：將提取到的DNA用DNA建庫試劑盒構建樣本DNA測序文庫；將提取到的RNA用RNA建庫試劑盒構建樣本RNA測序文庫；

步驟S3：對樣本DNA測序文庫和樣本RNA測序文庫進行高通量測序，且同時在同一條泳道上對DNA和RNA抽提和建庫的陰性對照進行測序；并對測序出來的序列數據進行初步篩選過濾掉干擾序列，得到處理后的樣本序列數據；

步驟S4：將樣本序列數據與參考數據庫進行比對，得到比對比例在70％以上且沒有多重比對的樣本序列和陰性對照序列，之后進行致病微生物的篩選，根據篩選結果即檢測出待測樣本中的呼吸道感染性疾病病原。

2.如權利要求1所述的基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法，其特征在于，所述致病微生物的篩選進一步包括：

分步驟S4A：去除背景微生物，具體為，

1)計算樣本序列和陰性對照序列中檢測到的每種微生物的RPM值；其中，微生物的RPM值是指每百萬微生物測序讀長中屬于該微生物的測序讀長數；

2)若樣本序列中檢測到的某一微生物同時存在于陰性對照序列中時，且樣本序列中該微生物的RPM值與陰性對照序列中該微生物的RPM值比值大于10時，則定義該微生物為待定陽性微生物；若樣本序列中檢測到的某一細菌、真菌或寄生蟲不存在于陰性對照序列中時，且在該樣本序列中該細菌、真菌或寄生蟲的RPM值大于50時，則定義該細菌、真菌或寄生蟲為待定陽性微生物；若樣本序列中檢測到的病毒不存在于陰性對照序列中時，且在該樣本序列中該病毒未重疊的測序讀長大于3條時，則定義該病毒為待定陽性微生物；

3)將所有的待定陽性微生物與背景微生物列表進行比較，去除存在于背景微生物列表中的待定陽性微生物，得到一份準陽性微生物列表；

分步驟S4B：篩選定植微生物，具體為，

將準陽性微生物列表中，在呼吸道定植菌群列表中出現過的微生物標記為P3，在常見病原微生物列表中出現過的微生物標記為P1，剩余的準陽性微生物標記為P2；則樣本中含有致病微生物可能性依次為含有標記為P1的微生物＞含有標記為P2的微生物＞含有標記為P3的微生物。

3.如權利要求2所述的基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法，其特征在于，所述背景微生物列表如下所示：

注：Taxid為美國國家生物技術信息中心數據庫中微生物的編號。

4.如權利要求2所述的基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法，其特征在于，所述呼吸道定植菌群列表如下所示：

注：Taxid為美國國家生物技術信息中心數據庫中微生物的編號。

5.如權利要求2所述的基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法，其特征在于，所述常見病原微生物列表如下所示：

注：Taxid為美國國家生物技術信息中心數據庫中微生物的編號。

6.如權利要求1所述的基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法，其特征在于，步驟S1中所述呼吸道待測樣本為痰液、肺泡灌洗液、有保存液的拭子樣本或沒有保存液的拭子樣本；步驟S1中提取到的DNA和RNA同時進行濃度測定和質量控制。

7.如權利要求1所述的基于宏基因/宏轉錄組測序的呼吸道感染病原檢測方法，其特征在于，在步驟S2中：所述構建樣本DNA測序文庫的步驟包括DNA片段化，末端修復，加接頭連接，片段選擇，純化，擴增以及純化；所述構建樣本DNA測序文庫的步驟包括去核糖體，RNA純化及片段化，末端修復，加接頭連接，片段選擇，純化，擴增以及純化。