[發(fā)明專利]一種花生籽仁對(duì)黃曲霉菌侵染抗性的室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010882254.6
• 申請(qǐng)日: 2020-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111979293A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張新友;崔夢(mèng)杰;韓鎖義;柴芃沛;郭俊佳;劉華;秦利;董文召
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/18
• 分類號(hào): C12Q1/18;C12N3/00;C12R1/67
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務(wù)所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛(ài)軍

本發(fā)明涉及一種花生籽仁對(duì)黃曲霉菌侵染抗性的室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定方法，包括黃曲霉菌菌株的選擇和培養(yǎng)；待鑒定花生籽仁的滅菌和復(fù)水；用黃曲霉菌孢子懸浮液接種健康花生籽仁；接種后在花生籽仁在培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7天；花生籽仁感染程度分級(jí)鑒定與感染指數(shù)的計(jì)算；最后確定花生籽仁對(duì)黃曲霉菌的抗性等級(jí)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，使用花生籽仁量少，重復(fù)穩(wěn)定性高，鑒定結(jié)果更加精準(zhǔn)，更易于分級(jí)與鑒定，可以精準(zhǔn)、快速的對(duì)花生籽仁抗黃曲霉菌侵染的育種材料進(jìn)行批量篩選，大幅度提高鑒定速度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種花生籽仁對(duì)黃曲霉菌侵染抗性的室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定方法，屬于植物種質(zhì)鑒定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

黃曲霉菌(Aspergillus flavus L.)侵染花生而導(dǎo)致的黃曲霉菌毒素(Aflatoxin)污染是影響花生食用衛(wèi)生安全性、限制花生種植及加工產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素。隨著花生生產(chǎn)效益的提高，我國(guó)花生種植面積逐漸擴(kuò)大，然而花生產(chǎn)后干燥及儲(chǔ)藏條件難以保障，花生籽仁的黃曲霉菌毒素污染問(wèn)題日益突出。培育和種植高抗黃曲霉菌侵染的花生新品種是解決花生黃曲霉菌毒素污染最為經(jīng)濟(jì)和有效的方式，然而建立精準(zhǔn)、快速的花生籽仁抗黃曲霉菌侵染的鑒定方法極為關(guān)鍵。

現(xiàn)有技術(shù)中鑒定花生對(duì)黃曲霉浸染的抗性通常采用的方法有，在花生生育后期的干旱處理或者田間接種花生植株，來(lái)鑒定花生對(duì)黃曲霉菌侵染的抗性，但此方法鑒定周期長(zhǎng)，容易對(duì)環(huán)境造成污染，且耗費(fèi)大量的人工；也有通過(guò)人工接種后檢測(cè)黃曲霉的含量，其檢測(cè)方法為薄層色譜法和高效液相色譜法，但其操作復(fù)雜、樣品檢測(cè)費(fèi)用高、對(duì)設(shè)備要求高，不能有效應(yīng)用于花生育種研究中的抗性鑒定；還有在人工接種花生籽仁后，稱量不同的花生籽仁在侵染前和侵染后的重量，最后計(jì)算黃曲霉菌侵染指數(shù)并進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，此方法雖然簡(jiǎn)單，但是不同的花生品種被黃曲霉菌侵染后，其含水量、蛋白質(zhì)、含油量等會(huì)出現(xiàn)不同程度的變化，結(jié)果誤差較大，難以鑒別花生籽仁的抗性水平。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種花生籽仁對(duì)黃曲霉菌侵染抗性的室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定方法，該方法在較為簡(jiǎn)單的試驗(yàn)條件下，利用較少數(shù)量的花生籽仁，即可精準(zhǔn)、快速的對(duì)花生籽仁抗黃曲霉菌侵染的育種材料進(jìn)行批量的篩選，大幅度的提高鑒定速度。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種花生籽仁對(duì)黃曲霉菌侵染抗性的室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定方法，包括以下步驟：

(1)黃曲霉菌株的選擇和培養(yǎng)：選取侵染能力強(qiáng)的黃曲霉菌菌株As.3.4408置于DG-18瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備黃曲霉菌孢子懸浮液；

(2)待鑒定花生籽仁的滅菌和復(fù)水：選取待鑒定品種飽滿、種皮完好、無(wú)病斑的健康花生籽仁30粒，分裝至3個(gè)已編號(hào)的無(wú)菌燒杯中，每個(gè)燒杯10個(gè)花生籽仁；在生物安全柜內(nèi)，向每個(gè)燒杯中加入體積濃度為75％的酒精溶液，浸泡2min后，倒掉酒精溶液；再向燒杯中加入無(wú)菌水沖洗，并浸泡4～6min，重復(fù)浸泡3次后，倒掉無(wú)菌水，將花生籽仁放入相應(yīng)編號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中；

(3)用黃曲霉菌孢子懸浮液接種健康花生籽仁：向所述無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入步驟(1)所得的黃曲霉菌孢子懸浮液0.5mL，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)無(wú)菌培養(yǎng)皿，使黃曲霉菌孢子能均勻的附著在花生籽仁表面，調(diào)整花生籽仁的間隙，使其均勻分布且互不接觸；

(4)將接種后的花生籽仁在培養(yǎng)箱中連續(xù)暗培養(yǎng)7天；

(5)花生籽仁感染程度分級(jí)鑒定與感染指數(shù)的計(jì)算：按照花生籽仁表面黃曲霉菌孢子的覆蓋率，將花生籽仁受侵染程度進(jìn)行0～5級(jí)分級(jí)；

(6)確定花生籽仁對(duì)黃曲霉菌的抗性等級(jí)：根據(jù)花生籽仁對(duì)黃曲霉菌感染指數(shù)的計(jì)算結(jié)果，將鑒定的花生籽仁材料分為高抗、抗、中抗、中感、感和高感黃曲霉菌6種類型。