[發(fā)明專利]用于DuHCV和DuMV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物組和探針組

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010882050.2
• 申請(qǐng)日: 2020-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111763774B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳翠騰;劉斌瓊;陳珍;朱春華;蔡國(guó)漳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 福州創(chuàng)蔚來(lái)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35290
• 代理人: 鄭艷艷

本發(fā)明涉及一種用于DuHCV和DuMV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物組和探針組，所述引物組和探針組的序列如SEQ.ID.No.1?SEQ.ID.No.6所示，本發(fā)明利用所述引物組和探針組建立的雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，能夠同時(shí)對(duì)鴨群中流行的DuHCV和DuMV的進(jìn)行檢測(cè)和精確定量，簡(jiǎn)化操作程序、節(jié)約成本、檢測(cè)快速、高效、特異性強(qiáng)且靈敏度高，DuHCV的最低檢測(cè)限為72.1拷貝/μL；DuMV的最低檢測(cè)限為60.8拷貝/μL。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于鴨丙型肝炎病毒和鴨新型微核糖核酸病毒雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物組和探針組。

背景技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(Real-time PCR)就是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于常規(guī)的PCR的缺點(diǎn)，real-time qPCR由于其操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)發(fā)展非常迅速，已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，比如基因的差異表達(dá)分析，SNP檢測(cè)，等位基因的檢測(cè)，藥物開(kāi)發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。目前根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用熒光化學(xué)物質(zhì)的不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)主要包括熒光染料和熒光探針兩類。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交探針(熒光共振能量傳遞探針)和分子信標(biāo)molecular Beacon。TaqMan探針?lè)ㄊ侵窹CR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，如FAM、VIC、ROX、JOE等，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，如Eclipse、TAMRA等。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在檢測(cè)病原時(shí)不僅可以定性檢測(cè)病原的有無(wú)，而且還可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸檢測(cè)技術(shù)上被廣泛使用。多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種特殊的熒光定量PCR形式，其突出的特點(diǎn)是一次實(shí)時(shí)熒光定量PCR可同時(shí)檢測(cè)多種病原，對(duì)病原復(fù)雜或存在多種基因型的病原鑒別檢測(cè)十分有效。

根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy ofViruses)的最新分類，黃病毒科(Flaviviridae Family)下設(shè)4個(gè)病毒屬：黃病毒屬(Flavivirus)，有53個(gè)病毒種，有些是人畜共患病原體，如流行性乙型腦炎病毒、登革熱病毒；丙型肝病毒屬(hepacivirus)，有14個(gè)病毒種；Pegivirus病毒屬，有11個(gè)種；瘟病毒屬(Pestivirus)，有11個(gè)種，常見(jiàn)的如豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是屬于黃病毒科、丙型肝炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直徑約40-60nm，核衣殼呈二十四面體對(duì)稱，核衣殼外包繞含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有刺突。鴨丙型肝炎病毒(duck hepacivirus，DuHCV)是從患有產(chǎn)蛋異常現(xiàn)象的鴨群中新發(fā)現(xiàn)的一種丙型肝炎病毒，其基因組具有一般丙型肝炎的特征，為單股正鏈RNA，基因組長(zhǎng)為11422bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)度為10824bp的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼的多聚蛋白長(zhǎng)為3607個(gè)氨基酸。