[發(fā)明專利]一種口蹄疫病毒致弱突變株及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010877384.0
• 申請日: 2020-08-27
• 公開（公告）號: CN111944770B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧曾軍;劉在新;李平花;袁紅;張杰;白興文;孫普;包慧芳;李娜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N7/00;A61K39/135;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發(fā)明提供了一種口蹄疫病毒致弱突變株及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)和生物制品技術(shù)領(lǐng)域。口蹄疫病毒致弱突變株是將親本口蹄疫病毒前導(dǎo)蛋白基因中的Lb AUG突變?yōu)锳TC或AAA，突變病毒在BHK?21細(xì)胞中的復(fù)制能力與親本毒株相似，但在PK?15細(xì)胞上的復(fù)制水平降低，對乳鼠的致病力顯著減弱，而且此突變類型能夠穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明在OZK/93?08疫苗株基因組結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上將前導(dǎo)蛋白基因中的第2個(gè)起始密碼子AUG突變?yōu)锳TC或AAA后，能顯著致弱O型口蹄疫病毒，是一種研制基因工程弱毒疫苗株的方法，將為口蹄疫O型滅活疫苗抗原的生產(chǎn)提供一個(gè)更安全的平臺。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種口蹄疫病毒致弱突變株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性、熱性、高度傳染性的動(dòng)物疫病，主要侵染偶蹄類動(dòng)物，包括牛，豬，綿羊和山羊等。該病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)法定報(bào)告的動(dòng)物傳染病之一，我國將其列為一類動(dòng)物疫病之首。目前，對口蹄疫最有效的控制策略主要是通過接種滅活疫苗以及屠宰感染和暴露的動(dòng)物來實(shí)現(xiàn)的。歐盟和南美的一些國家經(jīng)過幾十年免疫接種口蹄疫病毒滅活疫苗，已經(jīng)有效控制了口蹄疫，被認(rèn)為是滅活疫苗防控口蹄疫的標(biāo)桿。我國在2012年5月發(fā)布的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》中，明確將口蹄疫列為優(yōu)先防控的疫病，將疫苗免疫作為防控和凈化的核心技術(shù)手段。

滅活疫苗的生產(chǎn)需要昂貴的設(shè)施，在這些設(shè)施中大量增殖口蹄疫病毒強(qiáng)毒株，存在病毒從生產(chǎn)設(shè)施中逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。為了降低疫苗制造過程中散毒的生產(chǎn)隱患，方法之一是開發(fā)生物安全性提高的口蹄疫病毒株。這種工程毒株在BHK-21細(xì)胞(用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)的種子細(xì)胞系)中的復(fù)制能力不應(yīng)降低，但在其它干擾素全能型細(xì)胞中的復(fù)制能力減弱或者對敏感動(dòng)物的致病力減弱，即致弱毒株。因此，從“種毒”源頭改造口蹄疫疫苗強(qiáng)毒株，獲得致弱病毒株，對于提高疫苗生產(chǎn)過程中的生物安全性至關(guān)重要。

前導(dǎo)(leader,L)蛋白是一種木瓜蛋白酶樣蛋白酶，是口蹄疫病毒編碼的毒力因子，在口蹄疫病毒發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用。因此，對前導(dǎo)蛋白基因的操縱可能獲得工程可行的口蹄疫病毒致弱毒株。前導(dǎo)蛋白的翻譯起始于兩個(gè)不同的起始密碼子(Lab AUG和LbAUG)，間隔84個(gè)核苷酸(La區(qū)域)，這導(dǎo)致前導(dǎo)蛋白存在兩種形式，稱為Lab蛋白和Lb蛋白。起始密碼子的選擇利用是影響病毒蛋白翻譯起始的核心步驟之一，決定著病毒蛋白的翻譯效率，所以L基因中兩個(gè)起始AUG對口蹄疫病毒復(fù)制起著重要的作用。先前的研究已經(jīng)分析了兩個(gè)起始AUG的突變對病毒復(fù)制的影響，結(jié)果表明Lab AUG突變?yōu)閁GG并不妨礙口蹄疫病毒的拯救，但是Lb AUG突變?yōu)閁UU則拯救不到活的口蹄疫病毒。另一項(xiàng)研究表明，La區(qū)域內(nèi)插入57nt的轉(zhuǎn)座子導(dǎo)致Lb AUG的利用率降低，使得病毒對牛的致病力減弱。此外，La區(qū)域中插入表位標(biāo)簽(Flag)不會(huì)影響病毒的存活，但會(huì)消除或大大降低病毒利用Lab AUG起始蛋白翻譯活動(dòng)。這些已有的結(jié)果表明，Lab AUG和Lb AUG的選擇使用對于口蹄疫病毒的復(fù)制和致病力非常關(guān)鍵。迄今為止，國內(nèi)外尚無可用的Lb AUG修飾的口蹄疫病毒，也沒有Lb AUG修飾口蹄疫致弱毒株的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種口蹄疫病毒致弱突變株，所述突變株病毒具有致弱表型，對于提高疫苗生產(chǎn)中的生物安全性具有應(yīng)用潛力。

本發(fā)明提供了一種口蹄疫病毒致弱突變株，將口蹄疫病毒前導(dǎo)蛋白基因中的LbAUG突變?yōu)锳TC或AAA。

優(yōu)選的，突變?yōu)锳TC的前導(dǎo)蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No.2所示。

優(yōu)選的，突變?yōu)锳AA的前導(dǎo)蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No.4所示。

優(yōu)選的，所述前導(dǎo)蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No.5所示。