[發明專利]單B細胞篩選方法及其在小分子單克隆抗體制備中的應用

有效

• 申請號: 202010872160.0
• 申請日: 2020-08-26
• 公開（公告）號: CN112094810B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 王戰輝;沈建忠;溫凱;余文博;于雪芝;江海洋;楊玲;李強
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/0781
• 分類號: C12N5/0781;C07K16/44;G01N33/577;G01N33/53
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明公開了單B細胞篩選方法及其在小分子單克隆抗體制備中的應用。過改造小分子使其具有活潑基團(即半抗原)，并與對應的熒光素進行化學偶聯，分離純化后得到半抗原?熒光素的復合物；將所述復合物標記(人工抗原)免疫后的B細胞，作為待篩選細胞；使用流式細胞儀將帶有熒光的細胞分選收集，得到陽性B細胞。本發明還提供利用篩選得到的B細胞在小分子單克隆抗體制備中的應用。本發明通過半抗原?熒光素標記特異性B細胞，利用流式細胞儀進行快速分選，提前對融合的細胞進行篩選，去除了識別載體蛋白的B細胞，大大提高了識別小分子的B細胞的陽性率。

技術領域

本發明屬于細胞生物學領域，具體地說，涉及單B細胞篩選方法及其在小分子單克隆抗體制備中的應用。

背景技術

傳統的抗體制備是將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融合，再采用有限稀釋法經過多輪篩選從而獲得能產生抗原特異性抗體的雜交瘤細胞。但從脾細胞分離的B細胞并非都能有效的用于融合，有效融合比例僅為1:10⁵-10⁶，而融合后的雜交瘤細胞也僅有極少部分可分泌抗原特異性抗體。尤其在進行小分子半抗原免疫時，更有相當一部分是針對載體蛋白或“橋鏈”而非小分子本身。

本發明基于流式細胞術對小鼠特異性B淋巴細胞與雜交瘤細胞進行高效篩選并建立了快速高效的單克隆抗體制備方法。采用半抗原-熒光標記物富集抗原特異性B細胞，通過流式細胞儀分選去除載體蛋白和橋鏈抗體的影響，達到對陽性細胞的精準篩選，提高有效融合效率，實現高性能抗體的精準制備。

發明內容

本發明的目的是提供單B細胞篩選方法及其在小分子單克隆抗體制備中的應用。

本發明的另一目的是提供毒鼠強特異性抗體及應用。

本發明構思如下：通過改造小分子使其具有活潑基團(即半抗原)，并與對應的熒光素進行化學偶聯，分離純化后得到半抗原-熒光素的復合物；將所述復合物標記(人工抗原)免疫后的B細胞，作為待篩選細胞；使用流式細胞儀將帶有熒光的細胞分選收集，得到陽性B細胞。進一步地，將上述篩選方法獲得的B細胞用于小分子單克隆抗體的制備。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種B細胞篩選方法，包括：

1)針對小分子化合物A，設計具有活性基團的半抗原，將半抗原與熒光素進行化學偶聯，得到半抗原-熒光素復合物；

2)將步驟1)的半抗原與載體蛋白偶聯得到人工抗原；

3)用人工抗原免疫實驗動物，采血，分離得到外周血單核細胞；

4)用步驟1)的半抗原-熒光素復合物標記外周血單核細胞，然后利用流式細胞儀將帶有熒光的細胞分選收集，得到可特異性識別小分子化合物A的B細胞。

所述小分子化合物A可以是毒鼠強(TETS)。

優選地，毒鼠強半抗原的結構如式I)所示：

式I)所示的毒鼠強半抗原可參見CN109608479A。

所述熒光素可以是5-氨基熒光素、6-氨基熒光素。。

所述載體蛋白可選自牛血清白蛋白(BSA)、血藍蛋白、卵清蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白；優選牛血清白蛋白或血藍蛋白。

毒鼠強半抗原-熒光素復合物的結構如式II)所示：

進一步地，可采用如下方法制備式II)化合物：

(1)將式I)所示的毒鼠強半抗原43mg溶于1ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，將N,N’-二環己基碳化二亞胺(DCC)80mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)60mg加入到上述毒鼠強半抗原溶液中，室溫攪拌反應2h，得到活化的毒鼠強半抗原溶液；