[發(fā)明專利]基于核酸自我催化的邏輯環(huán)路及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010868287.5
• 申請日: 2020-08-26
• 公開（公告）號: CN112063696B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范小波
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

基于核酸自我催化的邏輯環(huán)路及其應(yīng)用，由5條核酸單鏈組成，所述核酸單鏈為B、C、D、E鏈和目標檢測鏈A；反應(yīng)起始時：B鏈和C鏈雜交，D鏈和E鏈雜交；加入目標檢測A鏈后，形成一個閉合的反應(yīng)環(huán)路：A置換C鏈并和B鏈雜交生成AB產(chǎn)物，C置換E鏈并和D鏈雜交生成CD產(chǎn)物，E置換C鏈并和B鏈雜交生成EB產(chǎn)物。本發(fā)明將描述新的基于熵驅(qū)動催化的核酸自我擴增的邏輯環(huán)路，顯著提高了基于熵驅(qū)動催化的核酸擴增的效率，可用于臨床RNA的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于熵驅(qū)動催化的核酸自我擴增的邏輯環(huán)路及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，臨床核酸檢測主要基于PCR/分子雜交和測序技術(shù)發(fā)展而來，這兩類技術(shù)對儀器和樣品要求較高，尤其是臨床常用的PCR/分子雜交技術(shù)要求在超凈臺中完成，試劑和操作環(huán)節(jié)復雜，要求在精密的PCR儀中完成，不利于大規(guī)模應(yīng)用。

熵驅(qū)動催化（entropy-driven catalysis，EDC）是近年來發(fā)展起來的將核酸的鏈置換技術(shù)與DNA程序化自組裝結(jié)合起來的一種能部分移動或者隨時間變化動態(tài)非酶催化核酸納米技術(shù)。從朗訊公司貝爾實驗室的Bernard Yurke發(fā)現(xiàn)了核酸鏈置換現(xiàn)象到后來加州理工學院Erik Winfree等人基于該反應(yīng)設(shè)計出多種程序化的級聯(lián)瀑布式反應(yīng)，該方法已被廣泛應(yīng)用于各種核酸相關(guān)的納米技術(shù)領(lǐng)域，如核酸傳感器、核酸計算機等。通過借助計算機輔助計算，對反應(yīng)的核酸鏈的堿基序列進行精心得設(shè)計，該反應(yīng)體系可按照預先設(shè)計的反應(yīng)順序進行程序化反應(yīng)，且該方法顯示出極高的特異性，對核酸的單堿基錯配顯示出極高的敏感。基于此特性，使用EDC技術(shù)對核酸進行擴增可以獲得極高的特異度，滿足臨床對診斷實驗的要求。

基于支點的鏈置換（Toehold mediated strand displacement），是一種基于熵驅(qū)動催化的核酸單鏈之間的競爭結(jié)合反應(yīng)，其反應(yīng)過程主要決定于反應(yīng)過程中的吉布斯自由能變，無需任何酶催化反應(yīng)。根據(jù)反映前后是否會產(chǎn)生新的Toehold，可以將鏈置換反應(yīng)分為兩類：Toehold介導的鏈置換反應(yīng)（Toehold mediated strand displacement）以及Toehold介導的鏈交換反應(yīng)（Toehold exchange）。因反應(yīng)后不產(chǎn)生新的toehold，toeholddisplacement易于發(fā)生，其反應(yīng)的吉布斯自由能遠小于toehold exchange反應(yīng)。但是toehold exchange反應(yīng)因其反應(yīng)自由能接近于零，表現(xiàn)出對toehold區(qū)堿基錯配的極高特異性，因此選用toehold exchange反應(yīng)可滿足核酸檢測中對特異度的高要求。近年來，鏈置換反應(yīng)結(jié)合其他不同的檢測方法用于各種檢測方法、生物傳感器的構(gòu)建等方面已有大量研究。同時，該方法是一種等溫環(huán)境中進行的核酸擴增反應(yīng)，因此無需昂貴的實時熒光定量PCR儀，僅靠簡單的恒溫設(shè)備即可使得反應(yīng)進行；因反應(yīng)體系無需酶促，試劑盒成本低廉，且省去了相應(yīng)的存儲、運輸過程中的冷鏈成本。

但是，該技術(shù)存在著反應(yīng)擴增倍數(shù)不足的缺陷。據(jù)相關(guān)研究報道，通過不同的設(shè)計，在一小時等溫擴增后可擴增十到近千倍，這與聚合酶鏈式反應(yīng)的指數(shù)級擴增還有較大差距，導致其靈敏度不夠，易產(chǎn)生假陰性假陽性。本發(fā)明所述方法基于熵驅(qū)動催化可以實現(xiàn)核酸的高效擴增，提高方法靈敏度，并減少了檢測時間，在核酸檢測中有顯著應(yīng)用意義。

發(fā)明內(nèi)容

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種基于核酸自我催化的邏輯環(huán)路及其應(yīng)用，可以極大提高基于支點的鏈置換技術(shù)的信號擴增效率，本方法可以應(yīng)用于臨床、科研和制藥領(lǐng)域。

技術(shù)方案：基于核酸自我催化的邏輯環(huán)路，由5條核酸單鏈組成，所述核酸單鏈為B、C、D、E鏈和目標檢測鏈A；反應(yīng)起始時：B鏈和C鏈雜交，D鏈和E鏈雜交；加入目標檢測A鏈后，形成一個閉合的反應(yīng)環(huán)路：A置換C鏈并和B鏈雜交生成AB產(chǎn)物，C置換E鏈并和D鏈雜交生成CD產(chǎn)物，E置換C鏈并和B鏈雜交生成EB產(chǎn)物。