[發明專利]一種利用外施人工合成肽段提高蘋果抗旱性的方法

有效

• 申請號: 202010864892.5
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111972427B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 馬鋒旺;毛柯;蔣琦;李超;劉長海;龔小慶
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A01N47/44
• 分類號: A01N47/44;A01P21/00;A01G17/00;A01G7/06
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 程華

1.一種利用外施人工合成肽段提高蘋果抗旱性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、多肽合成

在生工生物工程(上海)股份有限公司通過化學合成方法合成MdEPF2多肽的成熟區，mEPF2的序列表如SEQ:ID:NO:1所示；

步驟2、合成肽透析重折疊

透析緩沖液：50mmo/L MES，pH6.0，配制完成后冷卻至4℃；

重折疊緩沖液：50mmol/L MES，pH6.0，GSH,1mmol/L，GSSG,0.2mmol/L，200mmol/L精氨酸乙酯，配制完成后冷卻至4℃；

將mEPF2合成肽溶解于水中，濃度1mg/mL；將多肽溶液裝入透析袋中，不超過透析袋體積的2/3，用透析夾封口；在500mL重折疊緩沖液中4℃透析2d，透析過程中使用磁力攪拌儀攪拌；

棄重折疊緩沖液，將透析袋放入500mL透析緩沖液中4℃透析10h，透析過程中使用磁力攪拌儀攪拌；重復本步驟2次；從透析袋吸出溶液即為mEPF2多肽的重折疊溶液；

重折疊多肽的HPLC檢測

色譜條件：C18色譜柱，波長214nm，進樣量10μL，流動相A：0.1％三氟乙酸水溶液，流動相B：含0.1％三氟乙酸的甲醇；梯度：0-20min，10％B-100％B；20-30min，100％B-100％B；30-35min，100％B-10％B，35-45min，10％B-10％B；

將水、mEPF2多肽的重折疊溶液和合成肽mEPF2的水溶液分別進樣；檢測mEPF2多肽的重折疊溶液的色譜圖在合成肽mEPF2的出峰位置是否有明顯的色譜峰，若沒有，表明合成肽mEPF2已經完全重折疊，如果有表明合成肽mEPF2尚未完全重折疊，需要重新進行重折疊步驟，之后再重新進行HPLC檢測；

步驟3、重折疊肽的濃度測定

吸取mEPF2多肽的重折疊溶液1μL，用核酸蛋白濃度測定儀測定280nm的吸光值A，濃度計量單位為mg/mL，濃度等于0.75A，其中，A：重折疊肽280nm下的吸光度；

步驟4、多肽對蘋果植株平邑甜茶處理

0.5MS溶液配制：

處理溶液配制：用0.5MS溶液將mEPF2重折疊合成肽稀釋至濃度5.7mgl/L，于4℃保存，2d內使用；

對照溶液配制：先通過沸水浴加熱mEPF2重折疊合成肽溶液30min使mEPF2肽段失活，再用0.5MS稀釋成5.7mgl/L的溶液；

蘋果植株處理：用處理溶液和對照溶液分別噴施平邑甜茶前兩片展開葉及幼芽的背面，每天3次；15d后提取RNA并觀察氣孔；測定水分散失速率；

步驟5、干旱處理條件下的多肽處理

平邑甜茶分成正常供水組和中度干旱組，兩組內一半苗子的前兩片展開葉及幼芽的背面噴施處理溶液，另一半噴施對照溶液，每天3次；持續3個月；處理后測量并比較葉片光合速率，相對含水量，水分散失速率，葉綠素濃度，丙二醛含量，電解質滲漏率，O2-、H2O2含量，SOD、POD、CAT酶活性。

2.根據權利要求1所述的利用外施人工合成肽段提高蘋果抗旱性的方法，其特征在于，步驟1中，通過化學合成方法合成MdEPF2多肽的成熟區mEPF2。

3.根據權利要求1所述的利用外施人工合成肽段提高蘋果抗旱性的方法，其特征在于，步驟2中，通過透析重折疊方法獲得具有生物活性的mEPF2多肽。

4.根據權利要求1所述的利用外施人工合成肽段提高蘋果抗旱性的方法，其特征在于，步驟4和步驟5中，所述噴施處理部位為平邑甜茶前兩片展開葉及幼芽的背面。