[發明專利]核苷檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 202010863992.6
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN114113347A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 戴建新;寇庚;黃衛紅;侯盛;郭懷祖;郭清城;徐進;張存超;朱亮
• 申請（專利權）人: 上海百邁博制藥有限公司;上海張江生物技術有限公司;越海百奧藥業（紹興）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種核苷的檢測方法及應用，本發明所述的方法采用超高效液相色譜法（UPLC）進行CHO宿主細胞培養基及細胞培養上清中有效成分的檢測，所述的方法能在15分鐘內快速地同時檢測出胞苷、次黃嘌呤、尿苷、鳥苷、胸苷及腺苷共6種核苷的成分及含量。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，本發明涉及一種核苷檢測方法及其應用。

背景技術

核苷酸是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質組成的化合物，核苷酸是一種小分子物質，在生物體內，核苷酸是一類非常重要的低分子化合物，具有多種重要的生理功能，可以作為脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）的前體，也可以作為生理、生化過程的調節物質參與生物體的物質代謝活動， 如參與生物體的能量代謝，與其相關的三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等。

根據糖的不同，核苷酸可分為核糖核酸及脫氧核糖核酸兩類，根據堿基的不同，可分為腺嘌呤核苷酸（腺苷酸、AMP）、鳥嘌呤核苷酸（鳥苷酸、GMP）、胞嘧啶核苷酸（胞苷酸、CMP）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸、UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸、TMP）、及次黃嘌呤核苷酸（肌苷酸、IMP）等。

核苷是含氮堿基與糖組分縮合成的糖苷，包含核糖核苷、脫氧核糖核苷兩類，常見的核苷有腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷）、及次黃嘌呤核苷等。核苷作為能量來源的一類物質，也會被添加在蛋白質類藥物生產過程中宿主細胞的培養基中。

目前生物類藥品的制備生產，尤其是蛋白質類藥物的制備生產，不再使用早期的由動物臟器或組織中分離的方法取得，而是使用基因工程技術的方法制備生產。使用基因工程技術獲得的蛋白質類藥物，大大降低了因動物源而引起的用藥風險，并且可以明顯的降低生產成本，提高蛋白質類藥物的生產質量及產量。

在蛋白質類藥物的制備生產過程中，常用的方法是將含有需要表達的蛋白質類藥物的基因序列的表達載體，轉染至合適的宿主細胞中，并進行宿主細胞的培養、表達。其中常用的宿主細胞有原核細胞、真核細胞，現有技術中，蛋白質類藥物的大規模生產表達多使用大腸桿菌、酵母菌或哺乳動物細胞，其中CHO細胞（Chinese hamster ovary cell，中國倉鼠卵巢細胞）是最常用的宿主細胞。

中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）哺乳動物表達系統被廣泛用于生產蛋白質類藥物，其中影響外源基因表達水平的因素有很多，涉及基因的復制、轉錄和轉錄后翻譯等各級水平；對于整體而言，宿主細胞的生長環境也是一個非常重要的影響因素。

在含有目標蛋白質類藥物基因的宿主細胞培養過程中，使用何種宿主細胞培養基是關鍵的控制因素。在蛋白質類藥物的生產過程中，不僅要求宿主細胞本身能夠快速生長，也要求該宿主細胞能夠更好的表達出目標蛋白質類藥物。對于含有不同外援基因的宿主細胞而言，需要不同類型的培養基來滿足其生長及外源基因的表達；根據所要求表達的目標蛋白質類藥物的性質、結構的不同，選擇不同類型的宿主細胞培養基。

所以，中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）哺乳動物表達系統中，宿主細胞使用的培養基種類是影響蛋白質類藥物大規模生產表達的重要因素。對于培養基中的各種成分的檢測，是確保表達系統能夠高效表達的關鍵技術手段。

發明內容

本發明提供一種核苷的檢測方法及應用，本發明所述的方法采用超高效液相色譜法（UPLC）進行CHO宿主細胞培養基及細胞培養上清中有效成分的檢測，所述的方法能在15分鐘內快速地同時檢測出胞苷、次黃嘌呤、尿苷、鳥苷、胸苷及腺苷共6種核苷的成分及含量。

現有的核苷檢測方法多為毛細管電泳法和高效液相色譜法（HPLC），只能對少數幾個核苷進行同時檢測，耗時長、檢測核苷種類不夠，且目前未有專門針對CHO宿主細胞培養基及細胞培養上清中核苷檢測的方法。

現有技術中所提供的核苷檢測方法，耗時長、檢測成本高，且沒有一種方法可以一次性同時檢測胞苷、次黃嘌呤、尿苷、鳥苷、胸苷及腺苷共6種核苷的成分及含量。