[發明專利]一種結合破傷風毒素重鏈C端結構域的人源抗體及應用

有效

• 申請號: 202010863237.8
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111909265B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 陳薇;于長明;張冠英;于蕊;李建民;遲象陽;范鵬飛;房婷;劉渝嬌;郝勐;董韻竹;宋小紅;陳旖;劉樹玲
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10;A61K39/40;A61P31/04
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明公開了一種結合破傷風毒素重鏈C端結構域的人源抗體，所述抗體具有獨特的CDR區，與抗原的親和力達到0.397nM。所述抗體能夠有效中和破傷風毒素，可以完全保護破傷風毒素攻毒的小鼠。本發明提供的抗體具有獨特的作用位點，不同于現有技術中的抗破傷風毒素單克隆抗體的作用位點，提示其具有與其他中和抗體組成雞尾酒組合療法的潛力。

技術領域

本發明公開了一種單克隆抗體，屬于免疫學及微生物學技術領域。

背景技術

破傷風(tetanus)是由破傷風梭菌(C.tetani)引起的細菌性感染。破傷風梭菌經由皮膚或黏膜傷口侵入人體，在缺氧環境下生長繁殖，產生毒素而引起肌肉痙攣和自主神經系統功能障礙，若無醫療干涉，死亡率極高。破傷風梭菌的孢子廣泛存在于環境中，可以感染傷口、輕微擦傷，在新生兒破傷風中，可以感染新生兒的臍帶殘端。盡管破傷風在發達國家中很少見，但是在許多中低收入國家中仍然是一個巨大的診斷和治療挑戰。據估計，2015年新生兒破傷風造成的死亡人數為34019人。在許多國家，新生兒期以外發生的破傷風不屬于一種應報告的疾病，破傷風常見的國家很少有健全的報告制度或準確的發病率數據。盡管如此，國際出版的文獻中仍有大量病例報道，表明破傷風仍然是一個重大問題。根據全球疾病負擔(Global Burden of Disease,GBD)調查，2015年破傷風死亡人數估計為56743人。在發達國家，偶爾報告破傷風病例，最常發生在老年人口(≥60歲)或注射吸毒者中。

幸運的是，破傷風是一種可用疫苗預防的疾病。1924年，破傷風類毒素(TT)疫苗問世。一劑破傷風類毒素幾乎不能產生持久的免疫力，第二次免疫可在2-4周內保護約90％的個體，但許多個體的免疫力是短暫的，第三次免疫可以確保至少5年的普遍保護。由于該疫苗可有效預防破傷風，由它與百日咳菌苗、白喉類毒素組成的百白破疫苗已成為兒童免疫計劃的一部分。但是由于致病因子破傷風梭菌在環境中廣泛存在，因此破傷風不可能根除。

破傷風毒素(TeNT)是一種強效的神經毒素，以150kDa的單鏈蛋白質的形式產生，經過翻譯后修飾，形成由二硫鍵連接的重鏈HC和輕鏈LC，其HC進一步細分為C端結構域H_C和N端結構域H_N。Hc介導毒素與細胞表面的受體結合，這是毒素進入細胞的第一步；H_N介導輕鏈向胞漿的轉位，輕鏈是一種50kDa的金屬蛋白酶，負責發揮毒素作用。破傷風毒素在神經肌肉連接處與突觸前膜結合，隨后通過內源性微管軸突途徑在運動神經元內內化和逆行轉運。這種毒素經過細胞轉運，被突觸前抑制神經元吸收，在那里輕鏈被釋放到胞漿中。這種毒素的底物是囊泡相關膜蛋白2(vesicle-associated membrane protein 2，VAMP2)，是突觸囊泡對接和神經遞質釋放所必需的可溶性NSF附著蛋白受體(soluble NSF attachmentprotein receptor,SNARE)復合物的一部分。破傷風毒素在VAMP2一個特定的肽鍵(Gln76和Phe77之間)處的切割阻止了SNARE復合體的形成，從而阻止了鈣離子介導的胞吐作用。因此，運動神經的抑制信號減少，導致破傷風癥狀中的特征性痙攣。破傷風毒素與中樞興奮性突觸也有結合活性，能與交感腎上腺素能神經元結合，這可能導致了破傷風臨床癥狀中的自主神經失調。因此，抗TeNT-H_C抗體可以阻斷毒素與細胞表面受體的結合，從而阻止毒素進入細胞發揮中和作用；抗TeNT-H_N抗體可以通過抑制輕鏈向胞漿轉位而發揮中和作用。

破傷風的治療包括預防毒素吸收、控制肌肉痙攣和支持性護理，抗毒素和抗生素是目前僅有的特異性治療方法。抗毒素是由破傷風類毒素免疫人或動物(一般是馬)所得的血漿，經胃蛋白酶消化后純化制成的抗毒素球蛋白制劑，可以特異性地中和破傷風毒素，有效治療破傷風。但是，動物(馬)來源的抗毒素對于人體來說屬于異源蛋白，容易引起過敏反應，也存在傳播人畜共患傳染病的風險。免疫健康人所得的人破傷風免疫球蛋白(TIG)相比馬抗毒素不易引起過敏反應，但仍存在生產規模小、成本高的局限和傳染病傳播的風險。