[發(fā)明專利]一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010863150.0
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111979188A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟明耀;侯宗柳;李琳;劉紅巖;李健峰;李磊;顧玉琪
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇賽億細(xì)胞技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 張璽

1.一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)處理

胎兒分娩后，用生理鹽水沖洗胎盤組織，剝離羊膜，盡量去除血管組織；

2)清洗

將去除血管組織的胎盤置于含雙抗100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的緩沖液中反復(fù)沖洗3次；

3)培養(yǎng)

將清洗后的胎盤組織用無菌組織剪，剪碎成大小1～3cm³，將剪碎后的組織塊平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜止30-60分鐘，待水分揮發(fā)完后，加入含有10～20％胎牛血清的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)；

4)接種傳代

所述胎盤組織原代分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞生長達到80～90％融合后，即可傳代擴增培養(yǎng)，獲得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，用0.25％胰酶/EDTA消化細(xì)胞，按4000～8000個/cm²接種，接種后4～5天可以達到95％融合，融合95％以上所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以擴增至20代次以上。

2.如權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法，其特征在于：所述步驟2)中清洗的緩沖液為含雙抗100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水。

3.如權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法，其特征在于：步驟3)中所述10～20％胎牛血清的培養(yǎng)液中含有含核糖核苷的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液與胎牛血清。

4.如權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法，其特征在于：所述步驟3)中細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞培養(yǎng)3天后更換一次10～20％胎牛血清的培養(yǎng)液，之后每間隔2～3天更換10～20％胎牛血清的培養(yǎng)液，貼壁4～5天后即可見胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞從所述組織塊中爬出，7～10天后胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞可以達到80～90％融合。

5.如權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法，其特征在于：所述步驟3)中加入20～50ml/皿的含有10～20％胎牛血清的培養(yǎng)液。

6.如權(quán)利要求1所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法，其特征在于：還包括將步驟4)中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞進行質(zhì)量評估，所述質(zhì)量評估包括細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活性、細(xì)胞表面標(biāo)記物、分化功能、細(xì)菌檢測、支原體檢測、安全性評估。

7.如權(quán)利要求1至6任意一項所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)擴增方法，其特征在于：采用所述方法建立的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)規(guī)范、質(zhì)量控制體系及評估體系可以快速簡便的獲得臨床研究與應(yīng)用的間充質(zhì)干細(xì)胞。