[發(fā)明專利]一種印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010862442.2
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111944797A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 霍毅欣;王會(huì)艷;王寧
• 申請（專利權(quán)）人: 北京理工大學(xué)
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了涉及一種印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明只在提供一種印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得不同印楝組織中基因的轉(zhuǎn)錄情況，通過比對分析基因的表達(dá)水平獲得差異表達(dá)基因，并經(jīng)過生物信息學(xué)分析最終獲得能催化形成印楝素合成途徑中的關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

印楝素是一種具有殺蟲活性及醫(yī)藥活性的三萜類化合物，極高的應(yīng)用價(jià)值受到了人們的廣泛關(guān)注。然而，目前對于印楝素的合成途徑中關(guān)鍵基因及關(guān)鍵代謝中間體的報(bào)道較少。有限的基因信息限制了對印楝素合成的研究與生產(chǎn)，因此，亟需對其合成途徑中代謝中間體合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行挖掘，以實(shí)現(xiàn)印楝素的高效生產(chǎn)。

測序技術(shù)的快速發(fā)展使得快速獲得物種的基因信息成為可能，尤其是以高通量測序技術(shù)在植物轉(zhuǎn)錄組等領(lǐng)域的應(yīng)用，使得天然產(chǎn)物合成的相關(guān)基因的獲取變得快速簡單。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲取植物基因信息，挖掘植物天然產(chǎn)物合成途徑的關(guān)鍵基因和解析其合成途徑的策略已經(jīng)成功應(yīng)用于天然產(chǎn)物如紫杉醇，人參皂甙等例子中。

使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)獲取基因信息具有諸多優(yōu)勢，首先可直接獲得植物中基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，避免了植物基因中的內(nèi)含子對基因功能預(yù)測與驗(yàn)證的影響；其次，可以同時(shí)獲得多個(gè)基因在不同植物組織中的表達(dá)情況；第三，獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以提供植物中基因的表達(dá)水平差異，可為后續(xù)合成途經(jīng)中相關(guān)基因的篩選等提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序及分析方法，結(jié)合不同印楝組織中印楝素及衍生物的代謝物差異，從不同印楝組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異表達(dá)的基因中篩選獲得一種印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因OSC的方法，最終獲得了印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因，并成功獲得了該基因的完整序列，如圖1所示。發(fā)現(xiàn)該基因能催化形成印楝素的關(guān)鍵中間體，如圖2所示。

附圖說明

圖1印楝素合成關(guān)鍵中間體的相關(guān)基因。

圖2印楝素合成途徑。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)突進(jìn)獲取。

以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的限制。

實(shí)施例1、以差異表達(dá)分析方法獲得印楝素合成關(guān)鍵前體的基因。

結(jié)合不同印楝組織中印楝素的含量，定義轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)的對照組和實(shí)驗(yàn)組，即不含印楝素的組織為對照組，含量最高的組織為實(shí)驗(yàn)組。通過比較印楝不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基因的表達(dá)水平，將差異表達(dá)閾值設(shè)置為1，即基因表達(dá)差異是對照組中2倍時(shí)，認(rèn)定為差異表達(dá)基因；在獲取的基因中，選擇上調(diào)的差異表達(dá)基因中進(jìn)行生物信息學(xué)手段分析獲得了印楝素合成關(guān)鍵前體的相關(guān)基因。

以反轉(zhuǎn)錄方法獲取印楝素合成關(guān)鍵前體的相關(guān)基因：反轉(zhuǎn)錄PCR使用經(jīng)過DNase I處理的RNA(50ng)為模板，使用Promega的GoScript^TM的反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA；全長基因合成體系：2μL cDNA，2μL正向引物(10μM)，2μL反向引物(10μM)，25μL TsingKe的I-5^TM 2×High-Fidelity Master Mix，蒸餾水19μL，總體積50μL。擴(kuò)增條件為95℃變性20秒、56℃退火20秒、72℃延伸20秒(30個(gè)循環(huán))；72℃延伸5分鐘(1個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，其中電泳條件為電壓120v，電流400mA，電泳時(shí)間25分鐘，獲得2.3kb大小條帶，結(jié)果如圖1所示。

序列表