[發明專利]基于二硫鍵精準配對構建噬菌體展示多元環肽庫的方法

有效

• 申請號: 202010862365.0
• 申請日: 2020-08-25
• 公開（公告）號: CN111945231B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 吳川六;路帥敏;吳亞培
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N15/70;C40B40/02;C12R1/19
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

基于二硫鍵精準配對構建噬菌體展示多元環肽庫的方法，涉及環肽類化合物。實現精準調控三元環肽分子內的二硫鍵配對方式，將三元環肽模板融合表達于噬菌體表面，構建噬菌體三元環肽文庫。利用CPPC基序具有優先生成平行配對的二聚體的傾向性質，將兩個CPPC基序和兩個半胱氨酸插入多肽骨架中，實現有效調控二硫鍵的配對和多肽折疊，通過改變兩個CPPC基序和兩個半胱氨酸的排布位置，使具有不同多環拓撲結構的新型富二硫鍵環肽化合物得以從頭設計。無需借助天然環肽骨架和非天然氨基酸的插入，可以作為多環肽庫的模板，并利用該模板成功構建了噬菌體三元環肽文庫，篩選出并不是來源于天然產物支架結構的具有新結構的功能性環肽配體。

技術領域

本發明涉及環肽類化合物，尤其是涉及一種基于二硫鍵精準配對構建噬菌體展示多元環肽庫的方法。

背景技術

環肽類化合物是一類結構特殊、構象穩定、生物活性廣泛、作用機理獨特的環狀化合物，對靶標受體具有高的結合親和力和特異性、細胞毒性低、口服利用度高。因此，針對環肽類化合物進行配體藥物的研發引起了人們越來越多的關注。比如用于細菌及真菌性感染的環肽藥物Telavancin和Dalbavancin；抗腫瘤環肽藥物Lanreotide和Romidepsin，這些藥物都已經成功上市并發揮了重大的醫用價值。但是這些藥物中尤其是一些富含二硫鍵的環肽藥物，主要是提取于自然界的動植物。比如環肽藥物Linaclotide，由14個氨基酸組成，分子內含有三對二硫鍵構成三元環肽，衍生自多種可致腹瀉的大腸桿菌菌株所產生的熱穩定性腸毒素，用于治療成人的便秘性腸易激綜合征(IBS-C)和慢性特發性便秘(CIC)。這些環肽經過數百萬年的進化，不僅具有高度的結構剛性，而且具有結合包括細胞受體、離子通道蛋白等大量靶標的能力。但是這些進化后的環肽保留了很多保守氨基酸用于調控二硫鍵配對來穩定三級結構，因此在天然環肽基礎上進行改造的工作很大程度上僅僅局限于那些保守度較低的殘基部位，否則就會損害二硫鍵的配對和環肽結構。要想實現在不依賴于這些天然骨架的情況下，從頭設計耐受序列修改的富二硫鍵環肽骨架，對我們來說都是一個巨大的挑戰。

為了解決富二硫鍵環肽折疊過程中的復雜性和二硫鍵異構重排的問題，也已經發展出一些用于調控二硫鍵精準配對的工作，比如利用半胱氨酸類似物(Muttenthaler,M.etal.Solving the alpha-Conotoxin Folding Problem:Efficient Selenium-DirectedOn-Resin Generation of More Potent and Stable Nicotinic AcetylcholineReceptor Antagonists.J.Am.Chem.Soc.132,3514-3522(2010)；Zheng,Y.W.,Zhai,L.X.,Zhao,Y.B.Wu,C.L.Orthogonal Cysteine-Penicillamine Disulfide Pairing forDirecting the Oxidative Folding of Peptides.J.Am.Chem.Soc.137,15094-15097(2015).)(硒代半胱氨酸或者青霉胺)替代多肽鏈中的半胱氨酸殘基。雖然這些半胱氨酸類似物確實是有效調控了二硫鍵的配對方式，但是這些類似物都屬于非天然氨基酸，所以若將這些非天然氨基酸應用于生物體內表達多肽，工作量和難度都是很大的，因此發展出一種不依賴于非天然氨基酸而有效指導多肽的氧化折疊的方法是很有必要的。2012年，C.L.Wu等(Wu,C.L.,Leroux,J.C.Gauthier,M.A.Twin Disulfides for OrthogonalDisulfide Pairing and the Directed Folding of MulticyclicPeptides.Nat.Chem.4,1045-1050(2012))發現CXC基序和半胱氨酸間具有正交性配對的性質，因此設計合成了一系列含有CXC基序的多肽分子骨架，氧化折疊后獲得了特定配對方式的多元環肽。但是目標產物的產率還是相對來說較低，仍然會有許多其他二硫鍵配對構型的產物。因此如何在不借助天然環肽骨架和非天然氨基酸的插入的前提下，發展出一種從頭設計的耐受序列修改的多元環肽模板的新技術，從而實現三元環肽分子內更高精準程度的二硫鍵配對，用于噬菌體三元環肽文庫的構建，從而有望篩選出具有新結構的功能性環肽配體和治療性藥物。