[發明專利]基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202010858498.0
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN111999502B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 石星波;魯迨;趙倩
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/545;G01N33/543;G01N33/53
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

1.一種基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括AFB1單克隆抗體、生物素標記的AFB1核酸適配體、Cy5標記的cDNA和鏈霉親和素化的MNPs、鹽酸溶液和K₄Fe(CN)₆；該鏈霉親和素化的MNPs偶聯生物素標記的AFB1核酸適配體與Cy5標記的cDNA雜交形成的雙鏈DNA后得到檢測探針；以?MNPs為前體物，在鹽酸消解下釋放出?Fe³⁺，K₄Fe(CN)₆?與?Fe³⁺完全反應后得到原位生長的PBNPs。

2.如權利要求1所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的AFB1核酸適配體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

3.如權利要求1所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，其特征在于，所述Cy5標記的cDNA的序列如SEQ?ID?NO：2所示。

4.如權利要求1所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括96孔聚苯乙烯微孔板、PBS緩沖液、終止緩沖液及顯色底物。

5.一種基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測方法，其特征在于，該方法步驟如下：

（1）將生物素標記的AFB1核酸適配體與Cy5標記的cDNA按體積比1:1雜交，形成雙鏈DNA后加入到鏈霉親和素化的MNPs溶液中，以通過生物素與鏈霉親和素特異性結合，aptamer/cDNA修飾到MNPs表面，得到檢測探針aptamer@cDNA@MNPs；

（2）將AFB1單克隆抗體用PBS緩沖溶液稀釋后加入到96聚苯乙烯微孔板中，完成抗體包被；并用含牛血清白蛋白的PBS緩沖溶液封閉微孔板上的非特異性活性位點；

（3）向微孔板中分別加入樣品溶液以及濃度梯度的AFB1標準溶液，再加入步驟（1）制得的檢測探針、體積比為1:3的鹽酸溶液和K₄Fe(CN)₆溶液進行超聲反應；

（4）依據不同檢測要求根據AFB1標準溶液檢測結果繪制標準曲線，將樣品溶液檢測結果對應繪制的標準曲線，即可對樣品溶液中的AFB1進行檢測分析。

6.如權利要求5所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測方法，其特征在于，所述步驟（4）中的檢測要求包括光熱檢測、比色半定量檢測及熒光檢測。

7.如權利要求6所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測方法，其特征在于，所述光熱檢測中是用808?nm的紅外激光照射步驟（3）中超聲反應后的微孔板，通過溫度與AFB1標準溶液濃度之間的關系繪制標準曲線。

8.如權利要求6所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測方法，其特征在于，所述比色半定量檢測中是于808?nm紅外激光照射過的步驟（3）中超聲反應后的微孔板中加入雙氧水溶液和TMB溶液，通過反應溶液在652?nm處的紫外吸收值與AFB1標準溶液濃度之間的關系繪制標準曲線。

9.如權利要求6所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測方法，其特征在于，所述熒光檢測中是將步驟（3）中超聲反應后的微孔板中的溶液離心，取上清液；通過上清液的熒光強度與AFB1標準溶液濃度之間的關系建立標準曲線。

10.如權利要求5所述的基于PBNPs原位生長調控多模信號輸出的黃曲霉毒素B1檢測方法，其特征在于，所述步驟（3）中AFB1標準溶液的梯度濃度為10^-14-10^-7?g/mL。