[發(fā)明專利]一種比較體外誘導(dǎo)的PGC-like細(xì)胞遷移效率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010853561.1
• 申請日: 2020-08-24
• 公開（公告）號: CN111965094B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李碧春;袁霞;左其生;姜景譯;丁穎;石祥;張明;張亞妮;孫紅艷
• 申請（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 揚(yáng)州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

一種比較體外誘導(dǎo)的PGC?like細(xì)胞遷移效率的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。前期通過不同的誘導(dǎo)體系將ESCs或iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成PGC?like細(xì)胞，將獲得的PGC?like細(xì)胞進(jìn)行PKH26細(xì)胞膜表面標(biāo)記，然后注射至孵化2.5天的受體雞胚血管，封口后繼續(xù)孵化至4.5天，分離雞胚生殖嵴，進(jìn)行冰凍切片后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析PKH26紅色熒光的比例，從而比較不同體系誘導(dǎo)形成的PGC?like細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠明確對比出體外不同體系誘導(dǎo)的PGC?like細(xì)胞的遷移能力的差異。本發(fā)明切實(shí)可靠，嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確，成效顯著，為研究分析體外誘導(dǎo)的PGCs遷移歸巢至生殖嵴的能力提供了一種新穎可行且高效的實(shí)驗(yàn)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種比較體外誘導(dǎo)的PGC-like細(xì)胞遷移效率的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

PGCs移植技術(shù)是通過生殖細(xì)胞保存實(shí)現(xiàn)物種恢復(fù)的有效途徑，Chuma S等將小鼠的PGCs移植進(jìn)出生后小鼠的睪丸中使移植的PGCs分化為了精原干細(xì)胞并得到了后代。鳥類上由于PGCs能夠通過血液遷移的特點(diǎn)，Tagami T等將白來航雞PGCs注射至受體后成功獲得后代，成功復(fù)原了隱性白羽雞，陸陽清等通過相同的方法在白來航雞中成功實(shí)現(xiàn)東蘭烏雞和白來航雞的PGCs移植，并產(chǎn)生純種黑羽雞。PGCs由于其生殖細(xì)胞的發(fā)育潛能，能夠作為種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)和利用，也可以作為基因編輯的目的細(xì)胞生產(chǎn)基因編輯動物。

目前ESCs和iPS等多能干細(xì)胞可在適當(dāng)?shù)臈l件下被誘導(dǎo)分化獲得PGC-like細(xì)胞。本課題組前期建立了BMP4/BMP8b/EGF體系將ESCs和iPS分別誘導(dǎo)分化形成PGC-like細(xì)胞，并利用VPA/VK3/5-Aza等小分子誘導(dǎo)了這一誘導(dǎo)體系，同時也建立了原代PGCs遷移歸巢模型且成功產(chǎn)生了后代。但體外誘導(dǎo)形成的PGC-like細(xì)胞是否具有原代PGCs同樣的遷移歸巢至性腺的能力仍不清楚，因此，亟需對體外誘導(dǎo)形成的PGC-like細(xì)胞遷移效率進(jìn)行分析，研究通過體外誘導(dǎo)的PGCs 遷移歸巢至生殖嵴并產(chǎn)生后代的可行性和準(zhǔn)確性，為實(shí)現(xiàn)PGCs在禽類資源保護(hù)過程中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種新型的比較體外誘導(dǎo)的PGC-like細(xì)胞遷移效率的方法。本發(fā)明切實(shí)可靠，嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確，成效顯著，為研究分析體外誘導(dǎo)的PGCs 遷移歸巢至生殖嵴的能力提供了一種新穎可行且高效的實(shí)驗(yàn)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種比較體外誘導(dǎo)的PGC-like細(xì)胞遷移效率的方法，具體如下：

前期通過不同的誘導(dǎo)體系將ESCs或iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成PGC-like細(xì)胞，將獲得的PGC-like細(xì)胞進(jìn)行PKH26細(xì)胞膜表面標(biāo)記，然后注射至孵化2.5天的受體雞胚血管，封口后繼續(xù)孵化至4.5天，分離雞胚生殖嵴，進(jìn)行冰凍切片后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析PKH26紅色熒光的比例，從而比較不同體系誘導(dǎo)形成的PGC-like細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠明確對比出體外不同體系誘導(dǎo)的PGC-like細(xì)胞的遷移能力的差異。

本發(fā)明嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確，切實(shí)可行，應(yīng)用廣泛。 PGCs由于其生殖細(xì)胞的發(fā)育潛能，能夠作為種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)和利用，也可以作為基因編輯的目的細(xì)胞生產(chǎn)基因編輯動物，通過禽類ESCs/iPS誘導(dǎo)形成的PGC-like細(xì)胞異體/異種間移植產(chǎn)生后代。雞是非哺乳動物中研究遺傳學(xué)最重要的模式生物之一。因此本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法不僅在家禽上種質(zhì)資源保護(hù)過程中可行，在脊椎動物的其他研究領(lǐng)域也可應(yīng)用。這一發(fā)明將為體外誘導(dǎo)的PGC-like細(xì)胞介導(dǎo)后代雞的生產(chǎn)研究提供更多的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，也有利于對禽類種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)和利用，同時也有利于轉(zhuǎn)基因雞的生產(chǎn)研究。

具體實(shí)施方式