[發明專利]一種可用于異種器官移植的供體豬的構建方法

在審

• 申請號: 202010851140.5
• 申請日: 2020-08-21
• 公開（公告）號: CN111955422A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 周小青;唐成程;鄒慶劍;陳敏;賴良學
• 申請（專利權）人: 五邑大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發明涉及動物基因工程領域，尤其涉及一種可用于異種器官移植的供體豬的構建方法。本發明的構建方法包括以下步驟：(1)在豬胎兒成纖維細胞的基礎上，敲除GGTA1基因，同時轉入基因HLA?G5，得到GTKO/HLA?G5+克隆細胞；(2)將GTKO/HLA?G5+克隆細胞作為核供體進行體細胞核移植，培育得到重組胚，將重組胚移植入代孕母豬，妊娠后產仔得到供體豬。本發明構建了具有重要科研價值和應用前景的基因敲除和轉基因GTKO/HLA?G5+克隆豬，為異種器官移植提供重要的研究工具和新的研究途徑。

技術領域

本發明涉及動物基因工程領域，尤其涉及一種可用于異種器官移植的供體豬的構建方法。

背景技術

隨著基礎研究的不斷深入和臨床研究的日益完善，器官移植已經成為治療終末期器官疾病的首選之法。臨床醫學的發展和免疫抑制劑的開發，更使得同種器官移植獲得了顯著療效。但器官資源的嚴重短缺阻礙了同種器官移植的廣泛應用，據統計，目前全球等待移植的病人有600多萬人，病人數目還在不斷增加，發達國家的器官供應只能滿足15％的需要，約五分之一的病人在等待中死亡。日益突出的器官資源供求矛盾使異種器官移植研究應運而生?？茖W家們普遍認識到如果動物器官也能用于器官移植的話，那器官的來源問題將不再是難題。

目前，許多大動物已被應用于異種器官移植研究，豬，猴，猩猩，狒狒等，其中又以豬的研究最為廣泛。究其原因，以豬的器官作為異種供體源，因其有著得天獨厚的條件：其一，豬的同類器官與人的器官相比大小形態基本一致；其二，豬的繁殖周期短，生產力高，一窩產仔多；其三，與靈長類動物相比倫理問題相對較少。因此豬被認為是最理想的研究對象。雖然豬的器官結構和大小與人的器官相似，并可能作為異種器官移植的供體來解決器官短缺的問題，但是如果直接把正常的未經修飾的豬的器官移植到病人體內的話，會產生一系列免疫排斥反應，比如超急性排斥反應(HAR)，急性血管性排斥反應(AVR)，急性細胞排斥反應(ACR)等。解決這一問題的關鍵在于如何對豬的器官進行人源化改造，使其不被受體的免疫系統所排斥。

GGTA1，α-1，3-半乳糖基轉移酶基因，其催化生成的α-Gal是超急性排斥反應(Hyperacuterejection，HAR)的誘因。抗原α-Gal存在于豬和其它低等動物的細胞表面，由GGTA1基因調控。人體內不具有α-Gal抗原，但血清中存在大量的抗α-Gal抗體。因此如果進行豬-人異種器官移植，人體內該種抗體將與存在于異種物血管內皮細胞表面的異種抗原特異結合，引起凝血連鎖反應，特征為移植物短時間內出血、水腫、衰竭。因此在豬-人異種器官移植中會導致 HAR。移植實驗研究發現，取自GGTA1基因敲除豬的心或腎，移植到已免疫抑制的狒狒體內，分別成活179d和83d，與以往的實驗結果相比，延長了器官的存活時間，且都克服了HAR，因此敲除豬的GGTA1基因是克服豬異種器官移植免疫排斥反應的第一步。

異種器官移植過程中，NK細胞、CD4+和CD8+T細胞等免疫細胞的功能狀態決定了移植物的命運。HLA-G作為一種免疫耐受分子，可與這些免疫細胞表面的特異性受體相互作用，抑制受體的免疫應答作用，延長移植物的存活時間，在移植免疫耐受產生與維持中發揮重要作用。

發明內容

本發明對豬成纖維細胞進行GGTA1基因敲除，同時轉入HLA-G5基因，通過體細胞核移植技術獲得GGTA1基因敲除且轉HLA-G5的克隆豬，為異種器官移植提供新的研究工具和研究途徑。

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種可用于異種器官移植的供體豬的構建方法，所述構建方法包括以下步驟：

(1)在豬胎兒成纖維細胞的基礎上，敲除GGTA1基因，同時轉入基因 HLA-G5，得到GTKO/HLA-G5+克隆細胞；

(2)將GTKO/HLA-G5+克隆細胞作為核供體進行體細胞核移植，培育得到重組胚，將重組胚移植入代孕母豬，妊娠后產仔得到供體豬。