[發明專利]CD4陽性細胞特異性基因傳遞載體及其應用

有效

• 申請號: 202010848978.9
• 申請日: 2020-08-21
• 公開（公告）號: CN112226461B
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 刁勇;盛曉菁
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C07K7/06;A61K48/00;A61P31/18;A61P35/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明涉及分子藥物學分子醫學領域，特別是涉及CD4陽性細胞特異性基因傳遞載體及其應用。本發明提供了一種CD4陽性細胞特異性基因的傳遞載體，所述傳遞載體為在重組腺相關病毒(rAAV)的衣殼蛋白中插入一個七肽的重組腺相關病毒；所述七肽的氨基酸序列如SED ID NO：1～26中的任意一條所示。本發明通過在rAAV衣殼蛋白中插入一個七肽后，使得rAAV能夠靶向高效遞送轉基因元件至CD4陽性細胞。所述傳遞載體能夠選擇性轉導CD4陽性細胞，轉基因表達水平明顯高于野生型rAAV2載體，且能夠進行有效的靶向基因編輯。

技術領域

本發明涉及分子藥物學分子醫學領域，特別是涉及CD4陽性細胞特異性基因傳遞載體及其應用。

背景技術

CD4⁺T細胞(即CD4陽性細胞)是一類具有重要作用的免疫細胞，在許多疾病的發生與發展中，發揮重要作用，如HIV感染/艾滋病、多種癌癥、自身免疫性疾病和過敏性疾病。此外，CD4⁺T細胞通過與CD8⁺T細胞、B細胞和樹突狀細胞等不同免疫細胞相互作用，在免疫應答的協調方面發揮關鍵作用。因此，CD4⁺T細胞不僅是了解基礎免疫學的重要靶細胞，而且也是基因治療和免疫治療的重要靶細胞。

到目前為止，對CD4⁺T細胞的基因改造主要基于慢病毒載體(LVs)體外導入。然而，體外基因轉移需要經過細胞的分離、長期擴增和再融合等操作，以上操作可能改變細胞的特性，降低其在體內的持久性，并導致不良反應。因此，非常有必要開發一種CD4⁺T細胞特異性基因傳遞載體，無論是局部還是全身給藥的情況下，均可以起到將治療基因遞送到CD4⁺T細胞中。

理想的基因載體需要具備幾種特點：安全性高、不影響目的基因的表達、制備過程簡單、價格低廉、能夠長期穩定表達目的基因、具有靶向作用可將目的基因傳遞至靶細胞內、可調控目的基因在靶細胞內特異性表達等。因此，設計和開發安全、高效及靶向的基因載體是基因治療領域的研究重點。在眾多病毒載體中，腺相關病毒(AAV)由于高安全性及低免疫原性等優勢，成為基因治療最具前景的基因遞送載體。

重組腺相關病毒(recombinantAdeno-AssociatedVirus，rAAV)是人們利用DNA重組技術，對野生型AAV進行改造生產出來的可在人體內進行基因遞送的載體。rAAV的衣殼由三種分子量大小不同的衣殼蛋白(VP)組成，每一個rAAV顆粒中含有5個VP1、5個VP 2和50個VP3。VP1、VP2和VP3均由AAV病毒的同一個Cap基因編碼而成，羧基端完全一致。但由于轉錄起點不同，VP1比VP2在氨基端多37個氨基酸，VP2比VP3在氨基端多65個氨基酸。衣殼蛋白的氨基酸組成決定了rAAV的宿主細胞類型。當rAAV進入人體后，通過AAV病毒衣殼與細胞表面受體的相互作用進入細胞內部，在轉基因表達框內啟動子及增強子的調控下實現目的基因的表達，從而達到基因治療的目的。近年來，rAAV載體在許多人類疾病的基因治療中占據了中心地位。截至目前為止，已有176個rAAV藥物處于臨床試驗研究階段，極具應用前景。

盡管rAAV載體在基因治療的臨床應用上取得了成功，但作為CD4⁺T細胞的基因遞送系統仍面臨著重大挑戰。天然血清型AAV可以轉導多種細胞和組織，但對CD4⁺T細胞幾乎不具有轉導能力，必須進行適當改造。現有技術表明，將特異性靶向CD4陽性細胞的適體與siRNA結合，可以靶向轉染CD4⁺T細胞，且有效敲低CD4⁺T細胞內相關基因的表達水平，在人源化小鼠體內有效防止HIV的感染。還有研究表明，直接將可靶向結合CD4陽性細胞的DARPin序列融合進AAV衣殼蛋白，所得到的AAV載體可以靶向遞送至CD4⁺T細胞。但是，采用文獻方法對rAAV載體進行表面靶向配體修飾，特異性靶向CD4陽性細胞的適體的修飾效率不理想，DARPin序列融合后會極大地降低rAAV載體的生產效率，很難作為可臨床應用于CD4⁺T細胞的體內靶向基因遞送載體。

發明內容