[發明專利]布氏桿菌重組酶介導的等溫核酸擴增試劑盒

在審

• 申請號: 202010847081.4
• 申請日: 2020-08-21
• 公開（公告）號: CN112063727A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 李偉剛;徐博文;邵建宏;蔣曉霞;羅寶正;胡子楷
• 申請（專利權）人: 拱北海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 朱繼超

本發明公開了一種布氏桿菌重組酶介導的等溫核酸擴增試劑盒，包括正向引物BrucellaF和反向引物BrucellaR，以及標記有THF殘基的探針BrucellaP。基于上述技術方案，等溫核酸擴增試劑盒的擴增溫度為39℃，擴增時間為20分鐘，最低可檢測到100拷貝數的布氏桿菌樣品，且該特異性高。相對于其他PCR方法，本試劑盒不需要使用復雜的儀器和精良實驗室，只需要一臺恒溫熒光擴增儀。操作簡便的同時，反應耗時短，只需15?20分鐘即可完成擴增，且特異性、靈敏度都符合要求。適合畜牧業實地檢測或學校、實驗室對樣品進行研究前的快速檢測。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種針對布氏桿菌的重組酶介導的等溫核酸擴增試劑盒。

背景技術

布魯氏菌病(Brucellosis)，又稱布病、波狀熱。是由布氏桿菌(Brucella)引起的侵害關節和生殖系統的慢性流行性人畜共患疾病，在我國，該疾病的主要傳染源為牛、羊、豬3種牲畜，其中以羊型布氏桿菌對人體的傳播性最強，致病率最高，危害最為嚴重。布病主要損害人、畜的生殖系統和關節，對畜牧業的發展以及人類健康產生了較大的危害。目前，關于布氏桿菌的實驗室標準檢測方法主要為血清學方法。血清學的試管凝集試驗(SAT)、緩沖平板凝集試驗(BPAT)、虎紅平板凝集試驗(RBT)、全乳環狀試驗(MPT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、補體結合試驗(CFT)和熒光片振試驗(FPA)是現行布氏桿菌檢疫的標準方法。利用血清學方法檢測布氏桿菌所得到的結果相對可靠，但此類方法耗時久、操作繁瑣，且針對各種試驗方法在結果判定及影響因素都多少存在限制。奶制品、血清及部分組織含有的布氏桿菌較少，利用血清學方法檢測需要進行6周左右的增菌培養。

發明內容

本發明提供一種布氏桿菌重組酶介導的等溫核酸擴增試劑盒，該試劑盒特異性好，靈敏度高，操作簡便，反應耗時短。

一種布氏桿菌重組酶介導的等溫核酸擴增試劑盒，包括正向引物BrucellaF和反向引物BrucellaR，以及標記有THF殘基的探針BrucellaP；其中特異性引物和探針序列如下：

BrucellaF:5’-GGCCAGTTCCGAGATTGCGCCCGTCGGATAGCCGC-3’(SEQ ID No.01)；

BrucellaR:5’-CGCGTATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAA-3’(SEQ ID No.02)；

BrucellaP:5’-CCACAAAGAAATAGGCGTCCAGCGCACCAFCHTQCAGCCTCTCGCCTG-3’(SEQID No.03)；

其中，探針BrucellaP的序列中標注的F為熒光報告基團，H為四氫呋喃殘基，Q為熒光猝滅基團，探針的末端具有聚合酶延伸阻斷基團C3-spacer(C3-間臂)。

上述重組酶介導的等溫核酸擴增試劑盒是針對現有布氏桿菌各種型，因此選擇相對保守的基因片段進行擴增，具體是登陸于genbank的序列號為MG457036.1基因片段。

進一步，所述熒光報告基團可以選自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一種，所述熒光淬滅基團可以選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一種。

該等溫核酸擴增試劑盒還包括重組酶、單鏈結合蛋白、鏈置換DNA聚合酶、核酸外切酶凍干酶粉、Buffer A、Buffer B；所述Buffer A為水解緩沖液；所述Buffer B為醋酸鎂溶液。

進一步，該等溫核酸擴增試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為布氏桿菌陽性質粒標準體，所述陰性對照為ddH₂O或空載體質粒。