[發明專利]用于治療HCC的核酸、其制備方法、具有該核酸的CAR-T細胞及細胞的制備方法

有效

• 申請號: 202010844601.6
• 申請日: 2020-08-20
• 公開（公告）號: CN112159818B
• 公開（公告）日: 2023-02-21
• 發明（設計）人: 劉明錄;王立新;韓國英;韓慶梅;金海鋒;張傳鵬;強邦明;馬洪華
• 申請（專利權）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N5/10;C12N15/867;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 山東華君知識產權代理有限公司 37300
• 代理人: 張儉偉

本發明公開了用于治療HCC的核酸、其制備方法、具有該核酸的CAR?T細胞及細胞的制備方法，其序列中至少包含有如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激區核酸序列，以及如SEQ ID NO.7所述的4?1BB共刺激區核酸序列。本發明促進IFN?γ等細胞因子的產生從而克服肝腫瘤微環境的抑制作用，提高T細胞的浸潤率、增殖率和存活率，讓GPC3?226BB?CART細胞在注射到體內后，在腫瘤內存活并持續增殖，直到腫瘤被消除。

技術領域

本發明涉及基因技術領域，尤其涉及一種用于治療HCC的核酸、其制備方法、具有該核酸的CAR-T細胞及細胞的制備方法。

背景技術

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌，是目前全球最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居全球第五，死亡率位居全球第二。2018年2 月，國家癌癥中心發布了最新一期的全國癌癥統計數據，原發性肝癌全球每年新發病例85.4萬例，中國46.6萬，約占全球的55％；每年因原發性肝癌死亡81 萬例，中國為42.2萬，約占全球的45％-50％。目前針對常見早期肝癌的治療手段包括手術、肝臟移植以及放射治療。然而，許多患者由于很多具體情況不適宜使用上述方法，此外，這些療法成本高昂而且存在嚴重的副作用。

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾T細胞的過繼療法在腫瘤免疫療法的領域中是近年來新興的技術。這種治療方法通過對T細胞進行基因修飾，可使T細胞靶向作用于腫瘤細胞而發揮T細胞的殺傷功能。磷脂酰肌醇蛋白聚糖－3(GPC3)是HCC的一種重要腫瘤相關抗原。據統計，72％-81％的HCC患者腫瘤組織高表達GPC3蛋白。目前，以GPC3為靶抗原，制備表達抗GPC3嵌合抗原受體的T淋巴細胞(GPC3-226BB-CART)用于治療肝癌已成為研究熱點，但其療效仍不能令人滿意。這是因為肝腫瘤的EPR效應和強的免疫抑制微環境降低了CART細胞的浸潤率、增殖率和存活率。因此如何調控 GPC3-226BB-CART細胞對肝癌細胞的殺傷活性，增強肝腫瘤細胞對 GPC3-226BB-CART細胞殺傷的敏感性，是目前肝癌免疫治療研究中的關鍵問題。

CAR由三個區域依次組成，即胞外抗原結合區、跨膜區和胞內信號轉導區。對T細胞的激活和增殖起決定性作用的是胞內信號區，在最初研究，單個信號轉導區即胞內信號域免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)大多使用CD3ζ或FcεRIγ。ITAM發出的激活信號不能提供長時間的多克隆擴增和持續的體內抗腫瘤效應，只能引起T細胞短暫的分裂和較低水平的細胞因子分泌。后來，CAR引入了共刺激分子，共刺激分子包括B7/CD28和腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族，常用的是CD28或4-1BB。研究表明引入不同或不同數量的共刺激分子對CAR-T細胞在體內的存活時間、腫瘤定位的CAR-T細胞數量以及抗腫瘤能力都有影響。專利CN201310164725.X和專利CN201710502507.0都公開嵌合抗原受體 scFv(GPC3)-CD28-4-1BB-CD3ζ，其中在專利CN201310164725.X比較了引入不同或不同數量的共刺激分子CAR-T細胞對高表達GPC3肝細胞癌細胞系的殺傷率。但是，這種CAR-T細胞對肝細胞癌細胞系的殺傷率仍然有待于提高，而本領域技術人員一直沒有做出更大的改進。

因此，開發一種新用于治療HCC的核酸、其制備方法、具有該核酸的CAR-T 細胞及細胞的制備方法，不但具有迫切的研究價值，也具有良好的經濟效益和工業應用潛力，這正是本發明得以完成的動力所在和基礎。

發明內容

為了克服上述所指出的現有技術的缺陷，本發明人對此進行了深入研究，在付出了大量創造性勞動后，從而完成了本發明。