[發明專利]一種基于三維熒光光譜分析的產聚羥基脂肪酸酯菌的篩選方法

在審

• 申請號: 202010844387.4
• 申請日: 2020-08-20
• 公開（公告）號: CN111982875A
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 柴立偉;鄭維爽;黃藝
• 申請（專利權）人: 北京大學深圳研究院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 王燦

本發明屬于產聚羥基脂肪酸酯菌快速篩選的技術領域，提供了一種基于三維熒光光譜分析的產聚羥基脂肪酸酯菌的篩選方法。本發明的篩選方法包括如下步驟：(1)取待測菌液分離培養液，得到濃縮菌液，調節濃縮菌液的濃度后進行冷凍干燥，得到凍干菌粉；(2)在步驟(1)制得的凍干菌粉中加入正己烷，進行超聲提取，然后加入尼羅紅染色液進行染色，得到待測樣品；(3)取步驟(2)中的待測樣品進行三維熒光光譜分析。本發明提供的篩選方法，比傳統氣象色譜分析方法省工省力，大大提高了菌種的篩選效率，是一種全新的產聚羥基脂肪酸酯菌的篩選方法。

技術領域

本發明涉及產聚羥基脂肪酸酯菌的快速篩選技術領域，尤其涉及一種基于三維熒光光譜分析的產聚羥基脂肪酸酯菌的篩選方法。

背景技術

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是生物細胞內一類具有相似結構的功能性聚酯，作為能源儲備物質廣泛存在于微生物的細胞中。由于PHA的力學性質和熱塑性質與聚乙烯、聚丙乙烯具有相似性，因而可以開發利用為高分子材料。除此之外，PHA還具有生物可降解性和生物相容性，因而被認為是一種環境友好型生物基高分子材料，在包裝產業、有機農業、醫學材料以及先進傳感器研發方面具有重要的應用前景。

PHA作為一種聚合物，其組成的結構單體、單體排列方式和聚合度的不同使材料呈現出不同的力學性質，具有不同的應用場景。目前工業級的PHA生產高度依賴高效產PHA的微生物菌種。已有研究表明，不同種類的微生物產生的PHA類型可能有所區別。因此進行大規模的微生物菌種篩選，是未來進行PHA材料的改性，加速工業生產能力，降低生產成本的重要途徑。

隨著分子生物學技術的發展，通過鑒定PHA合成基因表達水平能初步篩選產PHA菌株。然而，基因型不等于表型，細菌產PHA能力，需要通過培養后定量或半定量確定。目前，使用最多的PHA定量方法是氣象色譜分析法。氣相色譜法的優點是定量準確，能夠提供復雜的物質組成信息，而缺點在于樣品提取較為費時費力，色譜分析需要較長時間的樣品前處理過程，對操作人員的熟練程度也有較高的要求，不適于大規模的篩選。另一方面，親脂性熒光染料尼羅紅，可以與PHA結合，在有機溶劑中發出熒光，以定性判斷細菌是否產PHA。但是，該方法敏感度低，特別是在當前培養條件不易于細菌累積PHA的情況下，則可能出現漏篩。三維熒光光譜分析是近年來在環境化學領域興起的一種新興有機物檢測方法，廣泛應用于自然源有機質和微生物分析物的有關研究。不同于傳統的熒光檢測方法，三維熒光光譜能夠提供樣品在連續激發光上的連續發射光熒光特征，具有高分辨率和高解析度的優勢，在材料學和環境科學有著廣泛的應用。而目前的研究表明PHA自身熒光特征不明顯，并不適用于熒光分析。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種基于三維熒光光譜分析的產聚羥基脂肪酸酯菌的篩選方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種基于三維熒光光譜分析的產聚羥基脂肪酸酯菌的篩選方法，包括如下步驟：

(1)取待測菌液分離培養液，得到濃縮菌液，調節濃縮菌液的濃度后進行冷凍干燥，得到凍干菌粉；

(2)在步驟(1)制得的凍干菌粉中加入正己烷，進行超聲提取，然后加入尼羅紅染色液進行染色，得到待測樣品；

(3)取步驟(2)中的待測樣品進行三維熒光光譜分析。

優選的，所述調節濃縮菌液濃度的方法為，在濃縮菌液中加入無菌水，調節其在600nm處的OD值為1.5～1.8。

優選的，所述冷凍干燥的溫度為-50～-70℃，時間為20～28h。

優選的，所述正己烷與待測菌液的體積比為1:0.8～1.5。

優選的，所述超聲提取的功率為300～500W，超聲提取的時間為3～8min。