[發(fā)明專利]一種基于Vcre-Vloxp重組酶體系的基因編輯方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010840799.0
• 申請(qǐng)日: 2020-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN111705079B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙金龍;朱石磊;李雯婧;林梓凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇集萃藥康生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/89
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種基于Vcre-Vloxp重組酶體系的基因編輯方法，其特征在于，所述基因編輯方法包括如下步驟：

（1）將Vloxp序列連接于雙鏈DNA的5′末端或3′末端，或者將所述Vloxp序列插入雙鏈DNA的功能區(qū)之間；

所述Vloxp序列為如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（2）再將所述雙鏈DNA、Vcre蛋白和基因編輯的反應(yīng)液混合，轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞中完成基因編輯和串聯(lián)片段的去除；

所述Vcre蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述雙鏈DNA中還包含Loxp序列、Loxp突變序列、Frt序列或Rox序列中的任意一種或至少兩種的組合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編輯方法，其特征在于，編碼所述Vcre蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因編輯方法，其特征在于，所述Vcre蛋白由表達(dá)Vcre蛋白的大腸桿菌工程菌合成得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編輯方法，其特征在于，步驟（1）中所述Vloxp序列連接于雙鏈DNA的3′末端。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編輯方法，其特征在于，步驟（2）中所述Vcre蛋白的工作濃度為80~120 ng/μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編輯方法，其特征在于，步驟（2）中所述雙鏈DNA的工作濃度為2~10 ng/μL。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編輯方法，其特征在于，步驟（2）中將混合后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)入所述目的細(xì)胞的方法包括原核顯微注射法。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因編輯方法，其特征在于，步驟（2）中所述目的細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編輯方法，其特征在于，所述基因編輯方法包括如下步驟：

（1）將Vloxp序列連接于雙鏈DNA的5′末端或3′末端，或者將所述Vloxp序列插入雙鏈DNA的功能區(qū)之間；

所述Vloxp序列為如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（2）再將所述雙鏈DNA、Vcre蛋白和基因編輯體系混合，使用原核顯微注射法將混合后的反應(yīng)液注入目的細(xì)胞中完成基因編輯和串聯(lián)片段的去除；

其中，所述Vcre蛋白的工作濃度為80~120 ng/μL，所述雙鏈DNA的工作濃度為2~10 ng/μL；

所述Vcre蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

所述雙鏈DNA中還包含Loxp序列、Loxp突變序列、Frt序列或Rox序列中的任意一種或至少兩種的組合。

10.如權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述的基因編輯方法在基因敲除、基因突變或基因定點(diǎn)整合中的應(yīng)用。