[發(fā)明專利]一種用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010835374.0
• 申請(qǐng)日: 2020-08-19
• 公開（公告）號(hào): CN112126987A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王俊;李小花;劉朝煜;姚旭梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳思凝一云科技有限公司
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京中南長(zhǎng)風(fēng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11674
• 代理人: 鄭海

1.一種用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法，其特征在于，它包括以下步驟：

1)第一次PCR擴(kuò)增：利用不依賴甲基化狀態(tài)的擴(kuò)增子引物，對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化過后的DNA進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，得到第一次PCR產(chǎn)物，完成對(duì)靶向區(qū)域的擴(kuò)增和富集；

2)一次磁珠純化：對(duì)步驟1)中得到的第一次PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化并且回收，得到第一次PCR回收產(chǎn)物；

3)補(bǔ)平修復(fù)：將步驟2)中得到的第一次PCR回收產(chǎn)物末端補(bǔ)平修復(fù)加A，得擴(kuò)增子；

4)接頭連接：利用連接反應(yīng)，將NGS測(cè)序用到的接頭加至步驟3)中得到的擴(kuò)增子兩端，得連接產(chǎn)物；

5)二次磁珠純化：對(duì)步驟4)中得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化并回收擴(kuò)增子連接產(chǎn)物；

6)第二次PCR擴(kuò)增：按照常規(guī)方法對(duì)步驟5)中回收的擴(kuò)增子連接產(chǎn)物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，從而將P5、P7序列加至文庫兩端,得到第二次PCR產(chǎn)物；

7)三次磁珠純化：對(duì)步驟6)中得到的第二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化并且回收，形成最終測(cè)序前的文庫。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法，其特征在于，步驟1)中，在針對(duì)靶向區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)控制引物長(zhǎng)度在20-25bp之內(nèi)，同時(shí)引物內(nèi)部不包含CpG位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法，其特征在于，步驟1)中，所述第一次PCR擴(kuò)增的退火溫度在55℃-65℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法，其特征在于，步驟1)中，所述DNA為待測(cè)樣品的基因組DNA提取而得。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法，其特征在于，所述提取采用本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)方法進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法，其特征在于，步驟6)中，所述第二次PCR擴(kuò)增的正向引物中帶有P5序列，反向引物帶有P7序列。

7.一種如權(quán)利要求1-6任一所述的用于甲基化擴(kuò)增子測(cè)序的建庫方法在甲基化測(cè)序中的應(yīng)用。